去甲烏藥堿與6-姜酚配伍對(duì)大鼠心肌收縮和收縮舒張的影響

去甲烏藥堿與6-姜酚配伍對(duì)大鼠心肌收縮和收縮舒張的影響

心力衰竭是一種慢性心臟功能的損害，心臟泵血障礙的主要原因是心臟肌實(shí)質(zhì)細(xì)胞的收縮能力減弱。目前治療心衰的一個(gè)重要方面是使用正性肌力藥物有效緩解心衰的癥狀。心肌正性肌力藥系指對(duì)心肌具有正性變力作用、能增強(qiáng)心肌收縮力,改善心臟泵血功能的一類藥物。傳統(tǒng)中醫(yī)典籍中雖未定義心衰,但類似心衰癥狀的早有記載,諸如呼吸困難,端坐呼吸,紫紺等。中藥的方劑和配伍制劑用于緩解心衰癥狀的治療由來已久。近期的研究表明,許多中藥的提取物或其有效成分配伍具有正性肌力作用。例如黃芪提取物可以改善阿霉素所致心衰大鼠的心功能,附子與干姜的配伍可以加快心衰大鼠的心率、升高左心室內(nèi)壓、提高左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率,改善心衰大鼠血流動(dòng)力學(xué)。附子的有效成分去甲烏藥堿和干姜的有效成分6-姜酚報(bào)道有心肌增強(qiáng)作用。但以往的研究尚多基于整體動(dòng)物和離體心臟,未見在心肌細(xì)胞收縮能力的報(bào)道。本研究主要考察去甲烏藥堿和6-姜酚及其相互配伍對(duì)心肌細(xì)胞收縮的作用。1材料表面1.1n-fmoce-1去甲烏藥堿(上海永恒生物科技有限公司,批號(hào)H1-111859),6-姜酚(成都曼思特生物科技有限公司,批號(hào)MUST-11030401)。1.2動(dòng)物SD大鼠250～300g,雄性,清潔級(jí),購于維通利華公司,生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京)2009-0007。1.3鈣臺(tái)氏液及消化液無鈣臺(tái)氏液(Tyrodesolution,mmol·L-1):NaCl140.0,KCl5.4,MgCl21.0,HEPEs10.0,D-Glucose10.0,NaOH調(diào)至pH7.4。有鈣臺(tái)氏液:在無鈣臺(tái)氏液基礎(chǔ)上添加1.2mmol·L-1CaCl2。KB液(mmol·L-1):KOH80.0,KCl40.0,KH2PO425.0,MgSO43.0,L-glutamic50.0,Taurine20.0,HEPEs10.0,EGTA1.0,D-glucose10.0,KOH調(diào)節(jié)至pH7.2。消化液:含0.6%collagenasetype2(Washington),0.6%BSA(Sigma),30μmol·L-1Ca2+的無鈣臺(tái)氏液。以上未標(biāo)注廠商均購自Alfa。1.4儀器美國IonOptix單細(xì)胞收縮與離子測(cè)量系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞收縮功能測(cè)量2方法2.1l-1復(fù)鈣的制備取250～300gSD雄性大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液(0.35g·kg-1)麻醉,開胸,迅速取出帶有一段主動(dòng)脈的心臟,于4℃臺(tái)氏液清理和沖洗殘余血液,并迅速掛于Langendorff裝置上進(jìn)行主動(dòng)脈逆行灌注,在36.7℃,6mL·min-1,恒速灌流。有鈣臺(tái)氏液灌流3min后切換無鈣臺(tái)氏液灌流5min,之后切換為消化液。灌流中同步檢測(cè)灌注壓,當(dāng)灌注壓恢復(fù)到略低于初始灌流壓力時(shí)終止消化,此時(shí)當(dāng)心臟松軟、顏色變淺。用10mL無鈣臺(tái)氏液灌流沖洗殘余消化液,然后在KB液中剪取左心室,用眼科鑷撕碎,以吸管小心吹打,500r·min-1離心40s,棄去上清液,更換KB液1次,間隔6min再次更換KB液。室溫靜置1h后開始復(fù)鈣,分別用0.3,0.6,1.2mmol·L-1含Ca2+臺(tái)氏液梯度復(fù)鈣,間隔6min。隨即可用于細(xì)胞收縮功能的測(cè)量。2.2細(xì)胞收縮檢測(cè)將適量細(xì)胞置于兩側(cè)有鉑金絲電極的浴槽內(nèi),顯微鏡下尋找橫紋清晰、收縮穩(wěn)定、邊界清楚的長桿狀細(xì)胞,于40×物鏡成像于計(jì)算機(jī),使用IonOptix單細(xì)胞收縮檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)時(shí)跟蹤細(xì)胞邊緣記錄收縮狀態(tài)。灌流1.2mmol·L-1Ca2+的氧飽和臺(tái)氏液,灌流速度1.5mL·min-1,給予頻率0.5Hz,波寬4ms的場(chǎng)刺激,細(xì)胞收縮幅度恒定5min后分別給與含有不同濃度藥物的臺(tái)氏液。2.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,統(tǒng)計(jì)使用SPSS16.0進(jìn)行分析,獨(dú)立樣本和兩組數(shù)據(jù)間的比較采用雙側(cè)t檢驗(yàn),以P<0.05為顯著性差異。3結(jié)果3.1mol-1對(duì)心肌細(xì)胞的收縮作用實(shí)驗(yàn)表明,去甲烏藥堿能夠增強(qiáng)心肌收縮力,起效迅速,洗脫后能夠恢復(fù)(圖1A)。0.03～1μmol·L-1能夠濃度依賴性增加心肌細(xì)胞的收縮幅度、最大收縮舒張速率(表1,圖1)。其EC50約為0.205μmol·L-1。高于1μmol·L-1心肌細(xì)胞即產(chǎn)生毒性,表現(xiàn)為心肌細(xì)胞不節(jié)律收縮。3.26最大收縮張量時(shí)間常數(shù)3～30μmol·L-16-姜酚對(duì)心肌細(xì)胞收縮幅度,最大收縮舒張速率,50%收縮舒張時(shí)間常數(shù)沒有影響,不能增強(qiáng)細(xì)胞收縮功能(表2)。大于30μmol·L-1能引起心臟的收縮功能障礙,表現(xiàn)為細(xì)胞的不節(jié)律收縮。3.3moll-1和3mol-1去甲烏藥堿的配伍實(shí)驗(yàn)結(jié)果選用3,10μmol·L-16-姜酚與0.1,0.3μmol·L-1去甲烏藥堿進(jìn)行兩兩配伍,結(jié)果顯示,配伍藥物依然能夠增強(qiáng)心肌細(xì)胞的收縮幅度和最大收縮舒張速率,但與單用去甲烏藥堿相比較沒有顯著性差異(表3)。4對(duì)心肌細(xì)胞的作用以往學(xué)者在心肌生化和離體水平進(jìn)行了中藥強(qiáng)心功能的研究,證實(shí)中藥能夠不同程度的改善心力衰竭的癥狀,并闡述其作用機(jī)制。本研究在心肌細(xì)胞水平測(cè)定了藥物對(duì)收縮功能的影響,其優(yōu)勢(shì)能夠直接判定藥物的作用部位,排除整體動(dòng)物的個(gè)體差異和神經(jīng)體液影響,利于更深入的機(jī)制研究。本研究使用附子、干姜的有效成分去甲烏藥堿、6-姜酚,并繪制其量效曲線,選擇合適濃度進(jìn)行更精準(zhǔn)的配伍研究。該研究方法所使用藥品成分單一,較少干擾。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:0.1～1μmol·L-1去甲烏藥堿能夠增強(qiáng)正常大鼠心肌細(xì)胞收縮力,但高于1μmol·L-1能夠引起心肌細(xì)胞的不節(jié)律收縮,表現(xiàn)其毒性作用。以往分子生物學(xué)結(jié)果顯示,3～10μmol·L-16-姜酚能夠升高心肌細(xì)胞SEARCA2a活性。但3～30μmol·L-16-姜酚急性灌流心肌細(xì)胞不能改變心肌細(xì)胞收縮力,并且30μmol·L-1的6-姜酚能夠引起細(xì)胞的不節(jié)律收縮。所以配伍研究選用3,10μmol·L-16-姜酚與0.1,0.3μmol·L-1去甲烏藥堿進(jìn)行兩兩配伍。結(jié)果顯示,配伍與單用去甲烏藥堿無顯著性差異。國內(nèi)外在去甲烏藥堿的強(qiáng)心作用和機(jī)制上做了大量的工作。去甲烏藥堿是非選擇性β受體激動(dòng)劑,其在血管,支氣管和心臟上廣泛發(fā)揮作用。但以往的研究尚缺乏在心肌細(xì)胞水平的研究,也沒有關(guān)于其量效曲線的報(bào)道。本研究首次報(bào)道在細(xì)胞水平起效濃度為0.1μmol·L-1,產(chǎn)生毒性的濃度為1μmol·L-1,EC50約為0.205μmol·L-1,治療窗較窄。這為去甲烏藥堿在整體動(dòng)物和臨床用藥提供重要的理論參考。分子生物學(xué)數(shù)據(jù)顯示6-姜酚在心肌細(xì)胞能夠提高Ca-ATPase活性,增強(qiáng)肌漿網(wǎng)的鈣回?cái)z功能,理論上能夠提高胞漿鈣的消除速率,增強(qiáng)舒張速率。但在心肌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)表明急性灌流6-姜酚不能增強(qiáng)心肌收縮力和舒張功能。展海霞等發(fā)現(xiàn)附子能夠增強(qiáng)急性心衰大鼠的心臟功能,附子與干姜的合煎劑較單用附子作用增強(qiáng)。中藥的作用機(jī)制復(fù)