中藥提取液抗銀屑病的作用機(jī)制研究

中藥提取液抗銀屑病的作用機(jī)制研究

在銀屑病的表皮上有許多細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子可以刺激角質(zhì)素（kc）對(duì)氟沙病樣本的變化。腫瘤壞死因子tnf（i）和白介素-8（il-8）在癲癇的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。本研究選用治療銀屑病的常用藥物制成單味中藥提取液，采用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，觀(guān)察了中藥提取液對(duì)TNF-α刺激后KC生長(zhǎng)的影響，并檢測(cè)中藥提取液對(duì)TNF-α刺激后KC分泌細(xì)胞因子IL-8的影響，探討中藥抗銀屑病的作用機(jī)制。1材料和方法1.1材料表面1.1.1細(xì)胞和起源人表皮鱗癌細(xì)胞株COLO-16，購(gòu)自北京師范大學(xué)。1.1.2主試劑包括重組人腫瘤壞死因子-α（rhTNF-α，購(gòu)自Promega公司）、人IL-8ELISA試劑盒（購(gòu)自晶美生物工程有限公司）等。1.1.3特效藥甲氨蝶呤、環(huán)孢素A標(biāo)準(zhǔn)品（98.8%）、中藥飲片（經(jīng)鑒定為國(guó)家藥典規(guī)定品種）。1.2方法1.2.1水提液的配制將藥物粉碎，過(guò)20目篩，超聲提取上清液，蒸發(fā)濃縮為100%液，加2倍體積95%乙醇，放置48h，過(guò)濾，蒸餾乙醇，得到100%的水提液，調(diào)pH值為8.0，抽濾去除沉淀，裝瓶密封，使用時(shí)調(diào)pH為7.0，過(guò)0.22μm濾膜除菌，加培養(yǎng)液配制成不同濃度的受試液。1.2.2中藥組加入dmem、tnf-的檢測(cè)培養(yǎng)的COLO-16細(xì)胞生長(zhǎng)接近單層時(shí)，消化后經(jīng)計(jì)數(shù)以每孔100μL(5×103個(gè)）接種于96孔板，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。接種24h后，顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞已貼壁生長(zhǎng)良好，達(dá)40%～50%融合，吸出各孔上清及未貼壁細(xì)胞，空白對(duì)照組僅加入DMEM培養(yǎng)液，另一組僅加入TNF-α（100U/孔），其余各組均在加入TNF-α的同時(shí)加入藥物，陽(yáng)性對(duì)照組分別加入環(huán)孢素A和甲氨蝶呤，濃度均為5mg/L；中藥組加入中藥液濃度為10g/L。加藥后繼續(xù)培養(yǎng)48h，每天在倒置顯微鏡下觀(guān)察生長(zhǎng)情況。1.2.3實(shí)驗(yàn)2加藥方法同上，但增設(shè)不加TNF-α刺激的陽(yáng)性對(duì)照藥組。加藥后繼續(xù)培養(yǎng)24h，測(cè)定細(xì)胞存活率，并收集上清液測(cè)定IL-8。1.2.4測(cè)定細(xì)胞活性的測(cè)定采用四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT法）。1.2.5il-8的測(cè)量用定量酶聯(lián)免疫吸附法（E-LASA法）。1.3統(tǒng)計(jì)方法以細(xì)胞存活率（藥物處理孔A值/培養(yǎng)液空白對(duì)照組A值）表示細(xì)胞繁殖程度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用組間t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1中藥提取物對(duì)tnf刺激后24小時(shí)和48小時(shí)c的血漿擴(kuò)散的影響見(jiàn)表1。中藥苦參、全蟹對(duì)tnf-刺激的抑制作用(1)TNF-α刺激24h及48h后，對(duì)體外培養(yǎng)KC的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，與空白對(duì)照組相比有明顯差異（P<0.001）。(2）環(huán)孢素A及甲氨蝶呤對(duì)加入TNF-α后KC的增殖表現(xiàn)出抑制作用，與單加TNF-α刺激組比較具有明顯差異（P<0.001）。(3)TNF-α刺激24h后，中藥苦參、全蝎對(duì)TNF-α刺激24h后KC的生長(zhǎng)具有抑制作用，與空白組及加TNF-α刺激組均有明顯差異；丹參、赤芍也表現(xiàn)出抑制作用，與TNF-α刺激組比較具有明顯差異，與空白組比較無(wú)明顯差異；牡丹皮未表現(xiàn)出對(duì)KC生長(zhǎng)的影響，與TNF-α刺激組相比無(wú)明顯差異；金銀花表現(xiàn)出促KC增殖的作用，與TNF-α刺激組相比具有明顯差異。(4)TNF-α刺激48h后，8味中藥均表現(xiàn)出顯著的抑制KC生長(zhǎng)作用。2.2在對(duì)tnf刺激后，中藥提取物對(duì)kc產(chǎn)生了細(xì)胞因子il-8的影響見(jiàn)表2。tnf-類(lèi)藥物單次給藥對(duì)il-8合成的抑制作用(1)TNF-α對(duì)KC分泌細(xì)胞因子IL-8具有促進(jìn)作用，與空白對(duì)照組具有明顯差異（P<0.01）。(2)8味中藥中6味中藥對(duì)TNF-α刺激KC分泌細(xì)胞因子IL-8的作用有抑制效果，其中拳參與單用TNF-α刺激組及空白對(duì)照組均有非常顯著差異（P<0.001），牡丹皮、赤芍、金銀花三味藥物與TNF-α刺激組相比有比較明顯差異（P<0.01），苦參、全蝎兩味藥物與TNF-α刺激組相比有顯著性差異（P<0.05）。丹參表現(xiàn)出抑制IL-8分泌的趨勢(shì)但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理無(wú)顯著性差異。(3）環(huán)孢素A及甲氨蝶呤對(duì)TNF-α刺激細(xì)胞因子IL-8的分泌均有抑制的趨勢(shì)，與TNF-α刺激組相比有明顯差異，二者之間相比較抑制作用無(wú)明顯差異；對(duì)空白組細(xì)胞因子IL-8的分泌有抑制趨勢(shì)但統(tǒng)計(jì)結(jié)果無(wú)顯著性差異。3聯(lián)合用藥對(duì)kc活性的影響銀屑病是一種炎癥增生性皮膚病，銀屑病的主要病理表現(xiàn)即為KC異常增殖、分化不全及局部炎細(xì)胞浸潤(rùn)等炎癥表現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者KC處于活化狀態(tài)，分泌高水平細(xì)胞因子且增殖活躍。KC在受到白介素-1(IL-1）、TNF-α等刺激后可大量分泌IL-8。IL-8對(duì)中性粒細(xì)胞具有強(qiáng)烈的趨化作用，并可促進(jìn)KC的增殖。研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者血清及皮損表皮內(nèi)IL-8水平均明顯增高，且與PASI積分相關(guān)。而在銀屑病皮損基底層、棘層及顆粒層均表達(dá)IL-8基因，與皮損周邊正常皮膚相比有明顯差異，提示皮損處異?；罨腒C為IL-8主要來(lái)源。有報(bào)道銀屑病患者KC高度增殖與KC高分泌、高表達(dá)具有促增殖作用的IL-8及其受體CXCR2有關(guān)。TNF-α是一種炎性細(xì)胞因子，它可誘導(dǎo)KC合成IL-8，可促進(jìn)KC和血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞間黏附分子，增強(qiáng)中性粒細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附能力，從而促進(jìn)炎癥細(xì)胞在局部的浸潤(rùn)和活化。有報(bào)道銀屑病患者皮損處TNF-α水平增高。研究發(fā)現(xiàn)銀屑病患兒血清TNF-α、IL-8水平明顯高于正常對(duì)照組，且TNF-α與IL-8水平呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)選擇治療銀屑病的常用中藥，觀(guān)察了單味中藥提取液對(duì)KC生長(zhǎng)增殖及分泌細(xì)胞因子IL-8的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNF-α能夠刺激KC生長(zhǎng)，并對(duì)其分泌細(xì)胞因子IL-8具有促進(jìn)作用，與陳先進(jìn)等報(bào)道一致。而8味中藥全部對(duì)TNF-α刺激后KC的生長(zhǎng)表現(xiàn)出顯著抑制作用，其中牡丹皮、赤芍等6味中藥同時(shí)對(duì)TNF-α刺激KC分泌細(xì)胞因子IL-8的作用有抑制效果，拳參、赤芍兩味藥物作用尤為明顯。這6味中藥中，拳參、金銀花屬清熱解毒藥；牡丹皮、赤芍屬清熱涼血藥；苦參屬祛風(fēng)燥濕藥；全蝎屬攻毒熄風(fēng)藥，其中以清