hIFNβ-HSA在畢赤酵母中的誘導(dǎo)表達(dá)及其降解蛋白酶的鑒定的開題報告

hIFNβ-HSA在畢赤酵母中的誘導(dǎo)表達(dá)及其降解蛋白酶的鑒定的開題報告一、研究背景和研究意義干擾素β(HumanInterferonBeta,HIFNβ)是一種具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性的重要蛋白質(zhì)。由于其廣泛的臨床應(yīng)用價值，人們對其生產(chǎn)工藝進行了長期的研究，目前已經(jīng)形成了以真菌或昆蟲細(xì)胞為表達(dá)宿主的生產(chǎn)技術(shù)。然而，由于這些表達(dá)宿主存在生長速度慢、細(xì)胞培養(yǎng)成本高、蛋白質(zhì)難以純化等問題，使得HIFNβ的生產(chǎn)成本極高，從而限制了其臨床應(yīng)用。畢赤酵母(Pichiapastoris)是一種單細(xì)胞真菌，具有高度可調(diào)節(jié)的真核表達(dá)系統(tǒng)，能夠高效表達(dá)同源外源蛋白，且表達(dá)產(chǎn)物易于純化。因此，使用畢赤酵母表達(dá)HIFNβ，可以有效解決HIFNβ的生產(chǎn)成本高的問題，并為其臨床應(yīng)用提供了更廣闊的前景。在畢赤酵母中表達(dá)HIFNβ的研究已經(jīng)取得了一定的成果。然而，畢赤酵母中表達(dá)的外源蛋白需通過胞外分泌途徑被分泌出細(xì)胞外，此過程中存在蛋白質(zhì)不穩(wěn)定、部分失活、較長的表達(dá)周期等問題，從而限制了其產(chǎn)量。因此，本研究計劃通過構(gòu)建高效的HIFNβ-HSA表達(dá)載體，并通過系統(tǒng)地優(yōu)化表達(dá)條件、篩選降解蛋白酶等手段，提高HIFNβ在畢赤酵母中的表達(dá)水平和穩(wěn)定性，為HIFNβ的生產(chǎn)提供更高效、更經(jīng)濟的方法，推動HIFNβ的臨床應(yīng)用。二、研究內(nèi)容1.構(gòu)建高效的HIFNβ-HSA表達(dá)載體本實驗將設(shè)計一種基于畢赤酵母的HIFNβ-HSA表達(dá)載體，通過PCR從HIFNβ和HSA源DNA中擴增出HIFNβ和HSA的開放閱讀框，并采用SOE-PCR的方法，將其連接起來。連接產(chǎn)物將用限制性內(nèi)切酶切開，并與表達(dá)載體pPICZαA連接，形成pPICZαA-HIFNβ-HSA表達(dá)載體。隨后，將鑒定重組質(zhì)粒中HIFNβ-HSA編碼序列和酶切位點的正確性。2.優(yōu)化HIFNβ-HSA表達(dá)條件本實驗將通過對信號肽和啟動子的選擇、過渡金屬離子和產(chǎn)酸模型添加物等條件的優(yōu)化，提高HIFNβ-HSA的表達(dá)水平。3.鑒定HIFNβ-HSA的表達(dá)水平和穩(wěn)定性本實驗將通過Westernblot和SDS鑒定HIFNβ-HSA的表達(dá)水平和穩(wěn)定性，同時測定不同HIFNβ-HSA表達(dá)菌株的菌體和培養(yǎng)液的生長情況，確定表達(dá)最佳菌株。4.篩選分泌過程中的降解蛋白酶本實驗將使用不同的降解蛋白酶針對HIFNβ-HSA進行分析，篩選分泌過程中的降解蛋白酶，探究其對HIFNβ穩(wěn)定性的影響，為提高表達(dá)產(chǎn)量提供參考。三、研究進度安排2020年12月：文獻(xiàn)綜述與實驗設(shè)備準(zhǔn)備2021年1月-2月：樣品采集、DNA擴增與質(zhì)粒構(gòu)建2021年3月-4月：對信號肽和啟動子等表達(dá)條件進行優(yōu)化2021年5月-7月：進行HIFNβ-HSA的表達(dá)水平和穩(wěn)定性的鑒定2021年8月-9月：篩選分泌過程中的降解蛋白酶2021年10月-11月：數(shù)據(jù)處理和結(jié)果分析2021年12月：論文撰寫和提交。四、預(yù)期成果本研究旨在通過構(gòu)建高效的HIFNβ-HSA表達(dá)載體、優(yōu)化表達(dá)條件、鑒定HIFNβ-HSA的表達(dá)水平和穩(wěn)定性以及篩選