第六章纖維素酶

第六章纖維素酶纖維素酶

一、纖維素酶特性及來(lái)源

二、纖維素酶的生產(chǎn)三、纖維素酶的應(yīng)用一、纖維素酶的特性及來(lái)源

分布化學(xué)組成纖維素01纖維素酶02纖維素酶的來(lái)源03

定義酶系組成

來(lái)源工業(yè)菌種一、纖維素酶的特性及來(lái)源

纖維素占植物干重的35％～50％，是地球上分布最廣、含量最豐富的碳水化合物。

纖維素的化學(xué)組成十分簡(jiǎn)單，是由β-D-葡萄糖通過(guò)β-1,4糖苷鍵連接而成的線(xiàn)形結(jié)晶高聚物，其聚合度很大，通常由4000～8000個(gè)葡萄糖分子串聯(lián)起來(lái)，分子質(zhì)量達(dá)200～2000kD。纖維素01一、纖維素酶的特性及來(lái)源

纖維素酶(cellulase)是指能水解纖維素β-1,4葡萄糖苷鍵，使纖維素變成纖維二糖和葡萄糖的一組酶的總稱(chēng)。它不是單一酶，而是起協(xié)同作用的多組分酶系。

目前普遍認(rèn)為纖維素酶系主要包括以下三類(lèi)酶組分。

(1)內(nèi)切葡聚糖酶(endoglucanase，EG，E.C.3.2.1.4)

(2)外切葡聚糖酶(CBH，E.C.3.2.1.91)

(3)β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，BG，E.C.3.2.1.21)纖維素酶02一、纖維素酶的特性及來(lái)源(1)內(nèi)切葡聚糖酶(EG，E.C.3.2.1.4)

系統(tǒng)命名為1,4-β-D-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，也稱(chēng)Cx酶。在纖維素的水解過(guò)程中，首先由EG從纖維素中部的無(wú)定形區(qū)進(jìn)行隨機(jī)切割，降低纖維素的聚合度，產(chǎn)生大量的小分子纖維素。EG作用于較長(zhǎng)的纖維素鏈，對(duì)末端鍵的敏感性比中間鍵小，但它不能單獨(dú)作用于結(jié)晶纖維素，只作用于纖維素?zé)o定形區(qū)或溶解性的纖維素衍生物以及酸膨脹等預(yù)處理的纖維素。纖維素酶02一、纖維素酶的特性及來(lái)源(2)

外切葡聚糖酶(CBH，E.C.3.2.1.91)

系統(tǒng)命名為1,4-β-D-葡聚糖纖維二糖水解酶，簡(jiǎn)稱(chēng)纖維二糖水解酶(CBH)，也稱(chēng)C1酶。CBH能從EG作用后的纖維素分子的非還原端(如里氏木霉的CBHⅡ)或者還原端(如里氏木霉的CBHⅠ)依次切下纖維二糖單位。其單獨(dú)作用于天然結(jié)晶纖維素時(shí)酶活力較低，但在EG酶的協(xié)同作用下，可以徹底水解結(jié)晶纖維素。纖維素酶02一、纖維素酶的特性及來(lái)源(3)β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，E.C.3.2.1.21，BG)

又稱(chēng)為纖維二糖酶(cellobiase，CB)。CB能水解纖維二糖和短鏈的纖維寡糖生成葡萄糖，它對(duì)纖維二糖和纖維三糖的水解很快，隨著葡萄糖聚合度的增加，水解速度下降。

酶解纖維素時(shí)，對(duì)無(wú)定形區(qū)僅EG即可使之水解，對(duì)于結(jié)晶區(qū)則需要有EG和CBH的協(xié)同作用，而且在結(jié)晶纖維素糖化過(guò)程中CB組分會(huì)使這種協(xié)同作用大大加強(qiáng)。纖維素酶02一、纖維素酶的特性及來(lái)源

對(duì)于天然結(jié)晶纖維素的水解，首先需要EG酶隨機(jī)水解切斷無(wú)定形區(qū)的纖維素分子鏈，使結(jié)晶纖維素出現(xiàn)更多的纖維素分子基端，為CBH酶水解創(chuàng)造條件，然后CBH酶作用于纖維素末端基釋放出纖維二糖，纖維二糖再由CB酶水解成葡萄糖，在上述三類(lèi)酶的協(xié)同作用下完成對(duì)纖維素的降解。因此，纖維素的完全降解有賴(lài)于這三類(lèi)酶的合適的比例，比例不當(dāng)時(shí)會(huì)顯著影響它們對(duì)纖維素的降解活力。纖維素酶02一、纖維素酶的特性及來(lái)源

纖維素酶來(lái)源非常廣泛，昆蟲(chóng)、軟體動(dòng)物、微生物(細(xì)菌、放線(xiàn)菌、真菌等)都能產(chǎn)生纖維素酶，如白蟻、小龍蝦等能產(chǎn)生完全不同于其內(nèi)共生微生物群所產(chǎn)的纖維素酶，反芻動(dòng)物的瘤胃微生物也擁有強(qiáng)大的纖維素降解酶系。

微生物發(fā)酵方法是纖維素酶大規(guī)模生產(chǎn)最有效途徑。纖維素酶來(lái)源03一、纖維素酶的特性及來(lái)源

不同微生物合成的纖維素酶在組成上有顯著的差異，對(duì)纖維素的降解能力也大不相同。

放線(xiàn)菌的纖維素酶產(chǎn)量極低，研究很少。細(xì)菌的產(chǎn)量也不高，且主要是內(nèi)切葡聚糖酶，大多數(shù)細(xì)菌所產(chǎn)纖維素酶對(duì)結(jié)晶纖維素沒(méi)有活性，另外，所產(chǎn)生的酶是胞內(nèi)酶或吸附于細(xì)胞壁上，很少能分泌到細(xì)胞外，增加提取純化難度，在工業(yè)上很少應(yīng)用。而絲狀真菌具有產(chǎn)酶的諸多優(yōu)點(diǎn)。纖維素酶來(lái)源03一、纖維素酶的特性及來(lái)源

絲狀真菌具有產(chǎn)酶的諸多優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)生的纖維素酶為胞外酶，便于酶的分離和提??；產(chǎn)酶效率高，且產(chǎn)生纖維素酶的酶系結(jié)構(gòu)較為合理；同時(shí)可產(chǎn)生許多半纖維素酶、果膠酶、淀粉酶等。從纖維素酶工業(yè)化制備及其應(yīng)用角度看，研究和采用絲狀真菌產(chǎn)酶具有更大意義。纖維素酶來(lái)源03一、纖維素酶的特性及來(lái)源

目前，用于生產(chǎn)纖維素酶的微生物菌種大多都是絲狀真菌，其中產(chǎn)酶活力較強(qiáng)的菌種為木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)和青霉屬(Penicillium)，特別是里氏木霉(Trichoderma

reesei)

及其近緣菌株較為典型，它遺傳性狀穩(wěn)定、具有較好的抗代謝阻遏能力而產(chǎn)酶活力高、其纖維素酶系完全、生長(zhǎng)環(huán)境粗放、酶易提取、且菌株安全無(wú)毒。

里氏木霉被公認(rèn)為是最具有工業(yè)

應(yīng)用價(jià)值的纖維素酶生產(chǎn)菌。纖維素酶來(lái)源03二、纖維素酶的生產(chǎn)

纖維素酶的生產(chǎn)通常采用固態(tài)發(fā)酵和液體深層發(fā)酵兩種工藝。無(wú)論采用何種工藝，我國(guó)纖維素酶生產(chǎn)菌種大多都采用經(jīng)誘變或經(jīng)基因改性的里氏木霉菌株，只有少數(shù)企業(yè)采用康氏木霉、黑曲霉或者青霉作為生產(chǎn)菌種。下面就以里氏木霉為例，簡(jiǎn)要介紹纖維素酶的生產(chǎn)工藝。

纖維素酶的固體發(fā)酵法是以麩皮、谷糠、玉米秸稈等農(nóng)業(yè)廢棄物為主要原料，發(fā)酵條件接近于自然狀態(tài)下真菌的生長(zhǎng)條件，發(fā)酵后的酶可直接進(jìn)行干燥、粉碎得到固體產(chǎn)品。

優(yōu)勢(shì)：所產(chǎn)纖維素酶系更齊全，有利于降解天然纖維素，固態(tài)發(fā)酵投資少，工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低；

劣勢(shì)：所產(chǎn)纖維素酶難于提取、精制，制得的酶制劑外觀(guān)粗糙且質(zhì)量不穩(wěn)定，生產(chǎn)效率較低，易污染雜菌，不適于大規(guī)模生產(chǎn)。

纖維素酶現(xiàn)代工業(yè)化生產(chǎn)的主要方式是液體深層發(fā)酵法。優(yōu)勢(shì)：原料利用率高、生產(chǎn)條件易控制、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、勞動(dòng)強(qiáng)度小、可大規(guī)模、自動(dòng)化生產(chǎn)。

劣勢(shì)：發(fā)酵動(dòng)力消耗大、對(duì)設(shè)備要求高。纖維素酶的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)工藝操作①種子培養(yǎng)將經(jīng)活化的PDA斜面上的里氏木霉菌種進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)。種子培養(yǎng)基一般由麩皮、谷糠及無(wú)機(jī)鹽類(lèi)組成，其配方如下：麩皮80g、谷糠20g、(NH4)2SO42％、NaNO30.15％、MgSO4·7H2O0.05％、KH2PO40.05％(無(wú)機(jī)鹽加量均指干料重的質(zhì)量百分?jǐn)?shù))，自然pH，加水2~3倍干料重，以拌好后可捏成團(tuán)但又?jǐn)D不出水滴為宜。里氏木霉纖維素酶的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)工藝操作①種子培養(yǎng)

將適量培養(yǎng)基裝入大三角瓶，滅菌后，取里氏木霉斜面孢子或事先制成的孢子懸液接入三角瓶,搖勻,置于28~30℃培養(yǎng)3~4d，至培養(yǎng)料長(zhǎng)滿(mǎn)孢子為止。視生產(chǎn)規(guī)模而定，三角瓶中的種子培養(yǎng)物可再擴(kuò)大培養(yǎng)一級(jí)，至曲盤(pán)種子，曲盤(pán)所用培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法同三角瓶，只是用三角瓶培養(yǎng)物接種。纖維素酶的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)工藝操作②厚層通風(fēng)發(fā)酵

發(fā)酵培養(yǎng)基常采用以下配方：粉碎過(guò)20目篩子的稻草粉85~95g、麩皮15～5g、(NH4)2SO4為干料重2.5％、水250～300mL。培養(yǎng)基于蒸球中滅菌1h，將滅菌物料攤布在無(wú)菌通道上，待冷卻至35～40℃之間備用。纖維素酶的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)工藝操作②厚層通風(fēng)發(fā)酵

滅菌物料冷卻至35～40℃之間后，將三角瓶或曲盤(pán)中的種子培養(yǎng)物拌入，接種量為0.2％~0.3％，混勻，裝入底部有篩孔的曲箱中，厚度以20～30cm為宜(最高可達(dá)60cm)，物料應(yīng)裝得均勻疏松，防止干燥或吹風(fēng)時(shí)龜裂引起通入的無(wú)菌空氣短路。纖維素酶的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)工藝操作②厚層通風(fēng)發(fā)酵

保持培養(yǎng)室溫度30～35℃，室內(nèi)相對(duì)濕度90％~100％，通過(guò)合理使用室內(nèi)循環(huán)風(fēng)和新鮮風(fēng)的比例，維持室內(nèi)相對(duì)濕度，當(dāng)旺盛發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)熱，品溫升高，超過(guò)規(guī)定溫度時(shí)，必須大量通風(fēng)以散熱，這樣間歇通風(fēng)直到發(fā)酵結(jié)束，一般發(fā)酵時(shí)間為64～72h。成品曲出箱后，打碎晾干。纖維素酶的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)工藝操作③纖維素酶制劑的制備

將打碎晾干后的成品曲進(jìn)一步粉碎，①若生產(chǎn)飼用纖維素酶，則可再經(jīng)氣流干燥，即制得酶制劑粗品；②若制備纖維素酶純品，則將粉碎的成品曲在28~30℃下用3倍水量浸泡2~3h，壓濾機(jī)壓濾或抽濾機(jī)抽濾，所得濾液用硫酸銨或乙醇沉淀，沉淀酶經(jīng)壓濾、干燥，再加穩(wěn)定劑、經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化混配后即成酶制品。沉淀時(shí)上清液，經(jīng)離心去雜，再經(jīng)超濾濃縮、噴霧干燥后回收酶粉。纖維素酶液態(tài)深層發(fā)酵生產(chǎn)里氏木霉茄子瓶孢子懸液硫酸銨或乙醇沉淀粉碎包裝干燥種子罐超濾濃縮菌種斜面搖瓶擴(kuò)培發(fā)酵罐過(guò)濾得上清液液體酶生產(chǎn)流程α-淀粉酶的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)工藝操作①種子罐培養(yǎng)

培養(yǎng)基成分可采用以下配方（質(zhì)量分?jǐn)?shù),％）：稻草粉1、麩皮0.5、葡萄糖1、(NH4)2SO40.2、KH2PO40.1、CaCO30.1、Tween-800.02，pH5.5～6.0。121℃下滅菌30min，冷卻后，接入三角瓶搖瓶種子或茄子瓶孢子懸液，28～30℃下培養(yǎng)24～36h，以備發(fā)酵罐接種用。纖維素酶液態(tài)深層發(fā)酵生產(chǎn)α-淀粉酶的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)工藝操作②發(fā)酵罐培養(yǎng)

發(fā)酵培養(yǎng)基為（質(zhì)量分?jǐn)?shù),％）：稻草粉5、麩皮0.5、蛋白胨0.3、(NH4)2SO41、KH2P040.4、CaCl2·2H2O0.2，MgSO4·7H2O0.03，Tween-800.02，pH5.5～6.0。121℃下滅菌30min，冷卻后，接入種子罐培養(yǎng)物，于28～30℃下培養(yǎng)96~120h。纖維素酶液態(tài)深層發(fā)酵生產(chǎn)α-淀粉酶的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)工藝操作②發(fā)酵罐培養(yǎng)

發(fā)酵過(guò)程中溫度的控制--發(fā)酵前期，培養(yǎng)溫度應(yīng)稍高些,以利于菌體的生長(zhǎng)，里氏木霉一般控制前期培養(yǎng)溫度為30℃。進(jìn)入產(chǎn)酶期后，應(yīng)適當(dāng)降低培養(yǎng)溫度，一般為28℃,較低的溫度有利于提高酶的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)細(xì)胞產(chǎn)酶時(shí)間。纖維素酶液態(tài)深層發(fā)酵生產(chǎn)α-淀粉酶的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)工藝操作②發(fā)酵罐培養(yǎng)

發(fā)酵過(guò)程中pH的控制--隨著發(fā)酵的進(jìn)行，體系的pH逐漸下降，此時(shí)不予控制，當(dāng)pH降至3.0以下時(shí)，可通過(guò)加入2mol/L的氨水來(lái)控制發(fā)酵液的pH維持在3.0±0.1，有利于產(chǎn)酶。發(fā)酵后期，隨著培養(yǎng)基成分的逐漸耗盡，pH開(kāi)始有所回升，此時(shí)不再加氨水，讓pH自然上升，直至放罐。纖維素酶液態(tài)深層發(fā)酵生產(chǎn)α-淀粉酶的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)工藝操作②發(fā)酵罐培養(yǎng)

發(fā)酵過(guò)程中通氣量的控制--里氏木霉是好氧菌，氧的不足將影響其生長(zhǎng)和纖維素酶的產(chǎn)生，所以應(yīng)保證發(fā)酵液中合適的溶氧量。發(fā)酵早期，菌體剛剛萌發(fā)，菌絲體數(shù)量較少，耗氧速率較低，應(yīng)控制通氣量為1:(0.2～0.3)；進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，菌體代謝旺盛，細(xì)胞大量分裂，菌絲體大量形成，此時(shí)耗氧速率加快，應(yīng)控制通氣量為1:1；產(chǎn)酶期，菌絲體數(shù)量最多，產(chǎn)生大量的酶蛋白，也消耗大量的氧氣，應(yīng)保持通氣量為1:1。纖維素酶液態(tài)深層發(fā)酵生產(chǎn)α-淀粉酶的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)工藝操作②發(fā)酵罐培養(yǎng)

放罐的判斷--以發(fā)酵液pH不再下降或回升，纖維素酶活力不再升高，并伴隨發(fā)酵液黏稠度明顯降低作為放罐的依據(jù)。一般發(fā)酵周期在96～120h，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，發(fā)酵液的濾紙酶活力(FPA)一般可達(dá)5～10U/mL，CMC酶活力可達(dá)60～100U/mL。纖維素酶液態(tài)深層發(fā)酵生產(chǎn)α-淀粉酶的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)工藝操作③纖維素酶的提取將發(fā)酵液過(guò)濾，除去固形物和菌絲體，得清液。若生產(chǎn)液體酶,可將清液超濾濃縮5～7倍，制成液體酶。對(duì)于固體酶的生產(chǎn)，先將清液pH調(diào)至4.5(纖維素酶等電點(diǎn)附近)，然后