利用基因組技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的基因打靶技術(shù)

利用基因組技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的基因打靶技術(shù)

將一些dna段插入動物細(xì)胞后，它們可以定位并與內(nèi)源級同源序列進(jìn)行重組。這種基因重組被稱為基因問題?；虼虬屑夹g(shù)可以用來生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物。在小鼠胚胎干細(xì)胞中應(yīng)用這一技術(shù)已生產(chǎn)出各種不同基因位點(diǎn)的突變體,可對小鼠中特異性基因的表型進(jìn)行評價。基因打靶技術(shù)不只是一種使基因失活的手段,而且可作為一種用來改變基因活性的方法。1基于dna的同源重組第1個攜帶有外源性基因的動物是將逆轉(zhuǎn)錄病毒——猿猴病毒40(SV40)DNA注射到小鼠的胚泡腔中產(chǎn)生的,但這些小鼠并沒有將SV40DNA整合到它們的生殖細(xì)胞中。第1次基因打靶實(shí)驗是用一種可選擇的人工位點(diǎn)的成纖維細(xì)胞系進(jìn)行的。在小鼠中,已做了大量的工作,并產(chǎn)生了各種突變體,另外,也有人通過使用純化基因DNA而使同源重組的效率提高。雖然,已經(jīng)證明未經(jīng)純化的DNA同樣成功的在小鼠胚胎干細(xì)胞和小鼠體細(xì)胞中進(jìn)行打靶,但是很明顯的使用基因純化的DNA時,重組的效率得到了很大的提高。純化基因DNA,即同被打靶的DNA具有100%,這在高度近交的實(shí)驗小鼠中并不是問題,但對于所有種類的遠(yuǎn)交家畜來說,確是至關(guān)重要的一個問題。為了克服這一問題,維持打靶基因的純化率,依賴于一種long-rangePCR技術(shù),這一技術(shù)基于DNA聚合酶的重組,能產(chǎn)生35kb大的擴(kuò)增子,比同源化的長度更重要的是酶的正確性相當(dāng)?shù)母?要達(dá)到錯誤率僅為1bp/100kb。有人發(fā)現(xiàn)Pfu1作為一種編輯和糾正的酶,錯誤率可以控制在可接受的范圍內(nèi)。但是對于純化基因片段產(chǎn)生的實(shí)際速度和難易程度來說,還依靠對于想要的基因所知的序列信息量。2基因沖突法適用于大型動物2.1核移植體的基因敲除增強(qiáng)綠色熒光蛋白基因(EGFP)比野生型GFP基因更適合用來作為一種報道基因,因為野生型的GFP基因在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)水平很低,EGFP的表達(dá)可在活細(xì)胞中被檢測到,所以,有人將EGFP基因和NeoR通過一種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)化到豬胎兒成纖維細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染的豬胎兒成纖維細(xì)胞經(jīng)過核移植后,構(gòu)建的胚胎成功的發(fā)育到胚泡期。這些胚胎在2細(xì)胞,4細(xì)胞,桑葚胚及胚泡期的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)EGFP,并且沒有鑲嵌現(xiàn)象,這一結(jié)果也說明了EGFP基因可以作為一種識別胚胎移植前的轉(zhuǎn)基因核移植后的豬胚胎的標(biāo)志物。有人將胎兒來源的成纖維細(xì)胞用含有EGFP的復(fù)制缺陷型載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用秋水仙素進(jìn)行處理(秋水仙素-使細(xì)胞同步進(jìn)入G2/M期),然后將這些細(xì)胞作為核供體進(jìn)行核移植,將細(xì)胞核注射到體外成熟的去核的豬卵母細(xì)胞的卵周隙中,融合并用電脈沖激活。融合后2小時,在大多數(shù)的重構(gòu)卵中均可檢測到熒光。在所有的核移植胚胎中,融合后15小時熒光變?nèi)?當(dāng)培養(yǎng)到48h后,熒光消失,但從第3天起,在2細(xì)胞,4細(xì)胞時期的胚胎中又開始表達(dá)EGFP。將200個1細(xì)胞時期的重構(gòu)胚移植到4只受體中,其中有3只動物懷孕,并且有1只受體豬產(chǎn)下1個健康的表達(dá)EGFP的轉(zhuǎn)基因后代。在豬向靈長類動物進(jìn)行器官移植的過程中,存在著的主要的障礙就是豬細(xì)胞表面的末端1,3半乳糖基(Gal)使異源移植過程中發(fā)生免疫排斥反應(yīng),導(dǎo)致失敗的器官移植。為了能夠克服在異源移植過程中由于Gal的存在而引起的排斥反應(yīng),賴良學(xué)等人通過敲除1,3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(GGTA1)位點(diǎn)而產(chǎn)生了4頭此基因被敲除的豬。1,3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(GGTA1)位點(diǎn)的敲除可以提供永久的和完全的保護(hù)。通過胚胎干細(xì)胞工程成功的獲得了此基因被敲除的小鼠,但對于有些家畜來說,還不能輕易的獲得ES細(xì)胞,所以,體細(xì)胞核移植技術(shù)的發(fā)展為在大動物中進(jìn)行基因的定點(diǎn)修飾提供了可能。在這一實(shí)驗中,研究者選擇在一高度近交的主要組織相容性復(fù)合體限定的小型豬系中進(jìn)行GGTA1位點(diǎn)的敲除,這樣大小的豬對于進(jìn)行臨床的器官移植非常適合。用一種基因捕獲打靶載體pGalGT來對一內(nèi)源性的GGTA1等位基因進(jìn)行同源的置換,載體包含有約21kb大小的與GGTA1位點(diǎn)同源的序列,對17個克隆進(jìn)行分析后,發(fā)現(xiàn)有8個包含有想象中的重組事件。獲得的這幾頭基因敲除豬是利用了核移植技術(shù),選擇經(jīng)過基因修飾過的克隆的胎兒成纖維細(xì)胞系作為核的供體,與去核的豬卵母細(xì)胞進(jìn)行胚胎的構(gòu)建。也有人用以一種細(xì)菌毒素為基礎(chǔ)的選擇過程來篩選細(xì)胞,在這些細(xì)胞中,Gal基因的第2個等位基因被敲除掉。序列分析顯示,Gal基因的第2個等位基因的敲除是由于1個在外顯子9的第2個堿基上的T到G的單個位點(diǎn)突變引起的,這可以導(dǎo)致Gal蛋白的活性喪失,通過3輪連續(xù)的克隆獲得4只健康的Gal1、3GT雙敲除的雌性小豬。還有人用2種其他的方法成功的產(chǎn)生出了GalT+/-的豬胎兒成纖維細(xì)胞。一種是用一基因純化的打靶構(gòu)建體進(jìn)行的正的陰性選擇物,另一種是使用帶有非純化DNA的無啟動子載體。迷你型豬由于它的體型小,以及與人在生理上具有某種相似性,對于醫(yī)學(xué)和藥理學(xué)的研究意義重大,所以對于轉(zhuǎn)基因的迷你型豬的研究也就變得很有價值了。首次成功的報道轉(zhuǎn)基因迷你型豬的獲得是通過原核顯微注射的方法實(shí)現(xiàn)的,從迷你型豬克隆得到的huntingtin基因與大鼠的神經(jīng)元特異性的烯醇化酶的啟動子區(qū)域相結(jié)合,通過顯微操作儀注射到受精卵的原核中,將受精卵再移植到這種豬的輸卵管中,通過PCR和Southern分析,成功的產(chǎn)出了5只具有轉(zhuǎn)基因特性的后代。2.2-actingfp的電融合與同源重組經(jīng)過基因修飾后的牛具有重要的農(nóng)業(yè)和人類醫(yī)藥價值。有人用體外培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因的胎兒細(xì)胞系進(jìn)行核移植,成功的獲得了后代小牛,這證明了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因克隆牛的可能性,并且用成體的顆粒細(xì)胞作為核供體進(jìn)行移植也同樣能成功的產(chǎn)生克隆牛,所以有人也嘗試用此細(xì)胞類型來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的克隆牛。他們將一含有EGFP基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞,核移植后的胚胎可以發(fā)育到胚泡期,并且通過研究發(fā)現(xiàn),晚期的轉(zhuǎn)基因成體細(xì)胞要比早期細(xì)胞更適合作為核供體。已知所有物種中的精子細(xì)胞都可以結(jié)合蛋白和DNA,因此,能用它們來作為載體,將外源的DNA在受精過程中導(dǎo)入卵母細(xì)胞中,外源DNA既能整合到精子染色體DNA中,又能通過精子轉(zhuǎn)導(dǎo)到卵中,并且隨后可整合到受精卵的基因組中。有人將牛的精子與Pst1β-actinGFPDNA構(gòu)建體進(jìn)行電融合,這樣能將這段DNA轉(zhuǎn)化到體外受精后的胚胎中。研究發(fā)現(xiàn),電融合的過程本身并不影響體外胚胎的發(fā)育,然而,經(jīng)過電融合的DNA處理的精子進(jìn)行受精后的卵母細(xì)胞發(fā)育到16細(xì)胞時期的比例卻相當(dāng)?shù)牡汀５硪环矫?電融合的使用可大大提高DNA的吸收。通過PCR檢測得出結(jié)論,電融合后發(fā)生同源重組的效率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于非電融合后的同源重組。用限制型性內(nèi)切酶介導(dǎo)的基因插入方法能獲得轉(zhuǎn)基因的牛精子,即用Not1-線性化的pEGFP和其相關(guān)的限制性酶對牛的精子細(xì)胞進(jìn)行脂質(zhì)轉(zhuǎn)染。將目的片段整合到精子基因組DNA中,然后用這種精子進(jìn)行體外受精,產(chǎn)生的桑葚胚能夠表達(dá)GFP。當(dāng)將轉(zhuǎn)基因的精子用來做人工授精時,產(chǎn)生的小牛在它們的淋巴細(xì)胞中檢測到外源DNA的表達(dá)。結(jié)果顯示,限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的基因插入是一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因精子,通過人工授精產(chǎn)生后代或通過體外受精產(chǎn)生胚胎的有效方法。將哺乳動物的人工染色體導(dǎo)入受精卵中是一種可行的且更有前景的產(chǎn)生重組蛋白的方法。哺乳動物人工染色體可以沿著受體染色體復(fù)制,而不會整合到同源的基因組中,并且有能力運(yùn)載大量的經(jīng)過設(shè)計后的帶有調(diào)節(jié)區(qū)域的DNA片段,這種調(diào)節(jié)區(qū)域可以使基因進(jìn)行組織特異性和長時間的表達(dá)。有人將人工的染色體顯微注射到體外成熟后體外受精的受精卵的原核中,人工染色體攜帶有LacZ基因或綠熒光蛋白基因,孵化的胚胎在封閉的STO細(xì)胞飼養(yǎng)層上培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),人工染色體導(dǎo)入牛受精卵中,也可以使胚泡繼續(xù)發(fā)育,并且報道基因的表達(dá)一直可維持整個著床前的發(fā)育過程。同樣,在牛中,也有人將EGFP作為報道基因,與核移植技術(shù)相結(jié)合來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的牛胚胎。將pCXNeo-EGFP構(gòu)建體顯微注射到牛的體外成熟-體外受精的受精卵的原核中,大多數(shù)表達(dá)EGFP信號的胚胎都是鑲嵌型的。將表達(dá)EGFP的卵裂球進(jìn)行核移植后,4.5%的由核移植卵發(fā)育來的桑葚胚在所有的卵裂球中均有很強(qiáng)的EGFP信號的表達(dá)。而在其他胚胎中,EGFP信號幾乎消失。當(dāng)來源于EGFP陽性的核移植桑葚胚的細(xì)胞被2次培養(yǎng)時,所有的細(xì)胞在第2階段均表達(dá)有很強(qiáng)的EGFP信號,并且顯示了新霉素抗性。這些結(jié)果表明,屢次呈現(xiàn)非整合的EGFP的暫時性表達(dá),并且在EGFP陽性卵裂球核移植后的EGFP陽性