細(xì)胞計(jì)數(shù)方法細(xì)胞計(jì)數(shù)板法

細(xì)胞計(jì)數(shù)辦法------細(xì)胞計(jì)數(shù)板法實(shí)驗(yàn)原理：當(dāng)待測(cè)細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時(shí)，通過測(cè)定一定體積懸液中的細(xì)胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。具體操作：1.將計(jì)數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板。2.將細(xì)胞懸液吸出少量，滴加在蓋片邊沿，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間，靜置3min，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。3.計(jì)算板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按公式計(jì)算：細(xì)胞數(shù)/mL=四大格細(xì)胞總數(shù)/4×10個(gè)/ml(注：當(dāng)細(xì)胞諸多時(shí)，可在四個(gè)格中選一定數(shù)目較平均的小格，由于每大格中有16個(gè)小格，然后計(jì)左側(cè)和上方的細(xì)胞數(shù)，求出每小格的細(xì)胞數(shù)，取平均值m，m×16即每個(gè)格的平均值。因此，細(xì)胞密度=m×16×10個(gè)/ml)闡明：公式中除以4，由于計(jì)數(shù)了4個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)。公式中乘以10由于計(jì)數(shù)板中每一種大格的體積為：（長(zhǎng)）×（寬）×（高）=而1ml=1000ul=1000mm（注意：鏡下偶見有兩個(gè)以上細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)10%以上，闡明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。）================================================細(xì)胞計(jì)數(shù)板的使用一、血球計(jì)數(shù)板-基本構(gòu)造血球計(jì)數(shù)板是一塊特制的厚型載玻片，載玻片上有四個(gè)槽構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)。中間的平臺(tái)較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個(gè)半邊上面各刻有一小方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng)共分九個(gè)大格，中央的一大格作為計(jì)數(shù)用，稱為計(jì)數(shù)區(qū)。計(jì)數(shù)區(qū)的刻度有兩種：一種是計(jì)數(shù)分辨為16個(gè)大方格（大方格用三線隔開），而每個(gè)大方格又分成25個(gè)小方格；另一種是一種計(jì)數(shù)分辨成25個(gè)大方格（大方格之間用雙線分開），而每個(gè)大方格又分成16個(gè)小方格。但是不管計(jì)數(shù)區(qū)是哪一種構(gòu)造，它們都有一種共同特點(diǎn)，即計(jì)數(shù)區(qū)都由400個(gè)小方格構(gòu)成。計(jì)數(shù)區(qū)邊長(zhǎng)為1mm，則計(jì)數(shù)區(qū)的面積為1mm2，每個(gè)小方格的面積為1/400mm2。蓋上蓋玻片后，計(jì)數(shù)區(qū)的高度為，因此每個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)的體積為，每個(gè)小方格的體積為1/4000mm3。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時(shí)，先要測(cè)定每個(gè)小方格中微生物的數(shù)量，再換算成每毫升菌液（或每克樣品）中微生物細(xì)胞的數(shù)量。二、細(xì)胞計(jì)數(shù)板-使用辦法1．視待測(cè)菌懸液濃度，加無菌水適宜稀釋（斜面普通稀釋100倍），以每小格的菌數(shù)可數(shù)為度。2．取干凈的細(xì)胞計(jì)數(shù)板一塊，在計(jì)數(shù)區(qū)上蓋上一塊蓋玻片。3．將菌懸液搖勻，用滴管吸取少量，從計(jì)數(shù)板中間平臺(tái)兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊沿摘入一小滴（不適宜過多），讓菌懸液運(yùn)用液體的表面張力充滿計(jì)數(shù)區(qū)，勿使氣泡產(chǎn)生，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多出菌懸液。也能夠?qū)⒕鷳乙褐苯拥渭釉谟?jì)數(shù)區(qū)上（不要使計(jì)數(shù)區(qū)兩邊平臺(tái)沾上菌懸液，以免加蓋蓋玻片后，造成計(jì)數(shù)區(qū)深度的升高），然后加蓋蓋玻片（勿使產(chǎn)憤怒泡）。4．靜置半晌，使細(xì)胞沉降到計(jì)數(shù)板上，不再隨液體漂移。將細(xì)胞計(jì)數(shù)板放置于顯微鏡的載物臺(tái)上夾穩(wěn)，先在低倍鏡下找到計(jì)數(shù)區(qū)后，再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察并計(jì)數(shù)。由于生活細(xì)胞的折光率和水的折光率相近，觀察時(shí)應(yīng)削弱光照的強(qiáng)度。5．計(jì)數(shù)時(shí)若計(jì)數(shù)區(qū)是由16個(gè)大方格構(gòu)成，按對(duì)角線方位，數(shù)左上、左下、右上、右下的4個(gè)大方格（即100小格）的菌數(shù)。如果是25個(gè)大方格構(gòu)成的計(jì)數(shù)區(qū)，除數(shù)上述四個(gè)大方格外，還需數(shù)中央1個(gè)大方格的菌數(shù)（即80個(gè)小格）。為了確保計(jì)數(shù)的精確性，避免重復(fù)計(jì)數(shù)和漏記，在計(jì)數(shù)時(shí)，對(duì)沉降在格線上的細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)應(yīng)有統(tǒng)一的規(guī)定。如菌體位于大方格的雙線上，計(jì)數(shù)時(shí)則數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線，以減少誤差。即位于本格上線和左線上的細(xì)胞計(jì)入本格，本格的下線和右線上的細(xì)胞按規(guī)定計(jì)入對(duì)應(yīng)的格中。見下圖：即本格中計(jì)數(shù)細(xì)胞為3個(gè)。6．對(duì)于出芽的酵母菌，芽體達(dá)成母細(xì)胞大小二分之一時(shí)，即可作為兩個(gè)菌體計(jì)算。每個(gè)樣品重復(fù)計(jì)數(shù)2-3次（每次數(shù)值不應(yīng)相差過大，否則應(yīng)重新操作），按公式計(jì)算出每mL（g）菌懸液所含細(xì)胞數(shù)量。7．測(cè)數(shù)完畢，取下蓋玻片，用水將細(xì)胞計(jì)數(shù)板沖洗干凈，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免損壞網(wǎng)格刻度。洗凈后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干，放入盒內(nèi)保存。三、細(xì)胞計(jì)數(shù)板-計(jì)數(shù)公式1、16格×25格的細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算公式：細(xì)胞數(shù)/ml=100小格內(nèi)細(xì)胞個(gè)數(shù)/100×400×10000×稀釋倍數(shù)1、25格×16格的細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算公式：細(xì)胞數(shù)/ml=80小格內(nèi)細(xì)胞個(gè)數(shù)/80×400×10000×稀釋倍數(shù)四、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的誤差重要來自哪些方面應(yīng)如何盡量減少誤差,力求精確血細(xì)胞計(jì)數(shù)的誤差分別來源于技術(shù)誤差和固有誤差。其中由于操作人員采血不順利，器材解決、使用不當(dāng)，稀釋不精確，細(xì)胞識(shí)別錯(cuò)誤等因素所造成的誤差屬技術(shù)誤差；而由于儀器（計(jì)數(shù)板、蓋片、吸管等）不夠精確與精密帶來的誤差稱儀器誤差，由于細(xì)胞分布不均勻等因素帶來的細(xì)胞計(jì)數(shù)誤差屬于分布誤差或計(jì)數(shù)域誤差（filederror）。儀器誤差和分布誤差統(tǒng)稱為固有誤差或系統(tǒng)誤差。技術(shù)誤差和儀器誤差可通過規(guī)范操作、提高純熟程度和校正儀器而避免或糾正，但細(xì)胞分布誤差卻難于徹底消除。因此，搞好紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的質(zhì)量控制普通需采用下列方法。1．避免技術(shù)誤差，糾正儀器誤差（1）所用器材均應(yīng)清潔干燥，計(jì)數(shù)板、血蓋片、微量吸管及刻度吸管的規(guī)格應(yīng)符合規(guī)定或通過校正。①計(jì)數(shù)板的鑒定：規(guī)定計(jì)數(shù)室的臺(tái)面光滑、透明，劃線清晰，計(jì)數(shù)室劃線面積精確。必要時(shí)采用嚴(yán)格校正的目鏡測(cè)微計(jì)測(cè)量計(jì)數(shù)室的邊長(zhǎng)與底面積，用微米千分尺測(cè)量計(jì)數(shù)室的深度。美國國標(biāo)局（NBS）規(guī)定每個(gè)大方格邊長(zhǎng)的誤差應(yīng)不大于1%，即1±，深度誤差應(yīng)不大于2%，即±。若超出上述原則，應(yīng)棄之不用。②血蓋片應(yīng)含有一定的重量，平整、光滑、無裂痕，厚薄均勻一致，可使用卡尺多點(diǎn)測(cè)量（最少在9個(gè)點(diǎn)），不均勻度在之內(nèi)。必要時(shí)采用平面平行儀進(jìn)行測(cè)量與評(píng)價(jià)，規(guī)定呈現(xiàn)密集平行的直線干涉條紋。最簡(jiǎn)樸的評(píng)價(jià)辦法是將干凈的蓋片緊貼于干燥的平面玻璃上，若能吸附一定的時(shí)間不脫落，落下時(shí)呈弧線形旋轉(zhuǎn)，表達(dá)蓋片平整、厚薄均勻。同時(shí)，合格的蓋片放置在計(jì)數(shù)室表面后，與支持柱緊密接觸的部位可見到彩虹。精選出的蓋片與其它蓋片緊密重疊后，在掠射光線下觀察，如見到完整平行的彩虹條紋表達(dá)另一枚蓋片質(zhì)量也符合規(guī)定。③現(xiàn)在臨床實(shí)驗(yàn)室多采用一次性微量采血管采集毛細(xì)血管血，除注意定點(diǎn)購置使用信譽(yù)較好廠家的產(chǎn)品外，還應(yīng)對(duì)每一批量的采血管進(jìn)行抽樣檢查，可通過水銀稱重法或有色溶液比色法進(jìn)行校正，誤差不應(yīng)超出±1%。（2）紅細(xì)胞稀釋液應(yīng)等滲、新鮮、無雜質(zhì)微粒。（3）嚴(yán)格操作，從消毒、采血、稀釋、充池到計(jì)數(shù)都應(yīng)規(guī)范，特別應(yīng)注意的是血樣稀釋及充池時(shí)既要作到充足混勻，又要避免激烈震蕩為破壞紅細(xì)胞。必須一次性充滿計(jì)數(shù)室，避免產(chǎn)憤怒泡，充入細(xì)胞懸液的量以不超出計(jì)數(shù)室臺(tái)面與血蓋片之間的矩形邊沿為宜。（4）報(bào)告法定計(jì)量單位。2．縮小計(jì)數(shù)域誤差或分布誤差由于血細(xì)胞在充入計(jì)數(shù)室后呈隨機(jī)分布或稱Poisson分布（），而我們所能計(jì)數(shù)的細(xì)胞分布范疇是有限的，由此造成的計(jì)數(shù)誤差稱為計(jì)數(shù)域誤差或分布誤差?？s小這種誤差的有效辦法就是盡量擴(kuò)大細(xì)胞計(jì)數(shù)范疇和計(jì)數(shù)數(shù)目，普通先進(jìn)行誤差預(yù)計(jì)，然后決定所需計(jì)數(shù)的數(shù)目和計(jì)數(shù)范疇，只要能將誤差控制在允許范疇內(nèi)即可。Berkson指出，當(dāng)使用同一支吸管、同一面計(jì)數(shù)室，計(jì)數(shù)面積的細(xì)胞數(shù)，有望將CV控制在可接受的7%以內(nèi)。對(duì)于紅細(xì)胞計(jì)數(shù)而言，由于紅細(xì)胞數(shù)量較多，在計(jì)數(shù)室中顯得比較“擁擠”，根據(jù)Poisson公式推斷，。欲將誤差控制在變異百分?jǐn)?shù)5%以內(nèi)，最少需要在計(jì)數(shù)室中計(jì)數(shù)400個(gè)紅細(xì)胞，因此規(guī)定計(jì)數(shù)五個(gè)中方格的紅細(xì)胞。事實(shí)上Berkson還通過實(shí)驗(yàn)證明，紅細(xì)胞的計(jì)數(shù)域誤差為s=，較理論誤差（Poisson分布誤差）要小。3．排除異常標(biāo)本的干擾白細(xì)胞數(shù)量在正常范疇時(shí)，相對(duì)于紅細(xì)胞數(shù)量來講，其影響可無視，但如白細(xì)胞過高（>100×109/L），則應(yīng)對(duì)計(jì)數(shù)成果進(jìn)行校正。辦法是：①實(shí)際RBC=計(jì)得RBC-WBC。如當(dāng)紅細(xì)胞換算后為×1012/L、白細(xì)胞換算后為100×109/L時(shí)，病人實(shí)際紅細(xì)胞數(shù)應(yīng)為×1012/L。②在高倍鏡下計(jì)數(shù)時(shí)，避開有核細(xì)胞。有核細(xì)胞體積比正常紅細(xì)胞大，中央無凹陷，無草黃色折光，可隱約見到細(xì)胞核。另外，當(dāng)病人急性嚴(yán)重貧血時(shí)網(wǎng)織紅細(xì)胞可提前大量釋放，也給紅細(xì)胞計(jì)數(shù)帶來一定的干擾，并且影響網(wǎng)織紅細(xì)胞絕對(duì)值計(jì)算成果。其校正辦法有待探討。UsingaCountingChamberFormicrobiology,cellculture,andmanyapplicationsthatrequireuseofsuspensionsofcellsitisnecessarytodeterminecellconcentration.Onecanoftendeterminecelldensityofasuspensionspectrophotometrically,howeverthatformofdeterminationdoesnotallowanassessmentofcellviability,norcanonedistinguishcelltypes.Adeviceusedfordeterminingthenumberofcellsperunitvolumeofasuspensioniscalledacountingchamber.Themostwidelyusedtypeofchamberiscalledahemocytometer,sinceitwasoriginallydesignedforperformingbloodcellcounts.Topreparethecountingchamberthemirror-likepolishedsurfaceiscarefullycleanedwithlenspaper.Thecoverslipisalsocleaned.Coverslipsforcountingchambersarespeciallymadeandarethickerthanthoseforconventionalmicroscopy,sincetheymustbeheavyenoughtoovercomethesurfacetensionofadropofliquid.Thecoverslipisplacedoverthecountingsurfacepriortoputtingonthecellsuspension.ThesuspensionisintroducedintooneoftheV-shapedwellswithapasteurorothertypeofpipet.Theareaunderthecoverslipfillsbycapillaryaction.Enoughliquidshouldbeintroducedsothatthemirroredsurfaceisjustcovered.Thechargedcountingchamberisthenplacedonthemicroscopestageandthecountinggridisbroughtintofocusatlowpower.Itisessentialtobeextremelycarefulwithhigherpowerobjectives,sincethecountingchamberismuchthickerthanaconventionalslide.Thechamberoranobjectivelensmaybedamagediftheuserisnotnotcareful.OneentiregridonstandardhemacytometerswithNeubauerrulingscanbeseenat40x(4xobjective).Themaindivisionsseparatethegridinto9largesquares(likeatic-tac-toegrid).Eachsquarehasasurfaceareaofonesquaremm,andthedepthofthechamberismm.Thustheentirecountinggridliesunderavolumeofmm-cubedSuspensionsshouldbediluteenoughsothatthecellsorotherparticlesdonotoverlapeachotheronthegrid,andshouldbeuniformlydistributed.Toperformthecount,determinethemagnificationneededtorecognizethedesiredcelltype.Nowsystematicallycountthecellsinselectedsquaressothatthetotalcountis100cellsorso(numberofcellsneededforastatisticallysignificantcount).Forlargecellsthismaymeancountingthefourlargecornersquaresandthemiddleone.Foradensesuspensionofsmallcellsyoumaywishtocountthecellsinthefour1/25sq.mmcornersplusthemiddlesquareinthecentralsquare.Alwaysdecideonaspecificcountingpattertoavoidbias.Forcellsthatoverlaparuling,countacellas"in"ifitoverlapsthetoporrightruling,and"out"ifitoverlapsthebottomorleftruling.?HereisawaytodetermineaparticlecountusingaNeubauerhemocytometer.Supposethatyouconductacountasdescribedabove,andcount187particlesinthefivesmallsquaresdescribed.Eachsquarehasanareaof1/25mm-squared(thatis,mm-squared)anddepthofmm.Thetotalvolumeineachsquareisx=mm-cubed.Youhavefivesquareswithcombinedvolumeof5x=mm-cubed.Thusyoucounted187particlesinavolumeofmm-cubed,givingyou187/=9350particlespermm-cubed.Thereare1000cubicmillimetersinonecubiccentimeter(sameasamilliliter),soyourparticlecountis9,350,000perml.Cellsareoftenlargeenoughtorequirecountingoveralargersurfacearea.Forexample,youmightcountthetotalnumberofcellsinthefourlargecornersquares