內(nèi)鏡管腔生物膜的形成和清洗研究

內(nèi)鏡管腔生物膜的形成和清洗研究

雖然報(bào)告了許多不合格的內(nèi)鏡消毒，但其中大部分是由于不嚴(yán)格的清潔和消毒，導(dǎo)致生物膜污染，這引起了醫(yī)院感染控制領(lǐng)域的關(guān)注。此外，還報(bào)道了纖維支氣管鏡檢查后的交叉感染，以及銅綠假單胞菌性肺炎的報(bào)道。因此,我們對(duì)內(nèi)鏡管腔形成的銅綠假單胞菌生物膜及不同清洗方法效果進(jìn)行了試驗(yàn)觀察。報(bào)道如下。1材料和方法1.1內(nèi)鏡管腔載體試驗(yàn)菌為銅綠假單胞菌ATCC15442,由中國(guó)科學(xué)院微生物菌種保藏管理中心提供;選取直徑為2.4mm的硅膠管、直徑為2mm的聚四氟乙烯管作為內(nèi)鏡管腔的載體;MODELBL100型蠕動(dòng)泵(1.0～100.0r/min),TM-1000型掃描電鏡(20～10000倍),無(wú)菌水(高壓蒸汽滅菌后的去離子水),醫(yī)院目前使用的內(nèi)鏡專用無(wú)酶清洗液(推薦使用濃度為1∶200稀釋),內(nèi)鏡專用多酶清洗液(推薦使用濃度為1∶200稀釋)、無(wú)菌專用毛刷。1.2方法1.2.1截干、滅菌參照陳海榮等的報(bào)道,制備含菌量(103～104)CFU/ml銅綠假單胞菌營(yíng)養(yǎng)肉湯菌懸液400ml。將聚四氟乙烯管、硅膠管截成2cm一段,脫脂處理,滅菌后備用。無(wú)菌操作將2種管材交叉連接成2m,進(jìn)液端硅膠管與蠕動(dòng)泵連接后,經(jīng)另一端回流到三角瓶形成一個(gè)封閉式循環(huán),菌液以35r/min的速度在管腔持續(xù)循環(huán)7～8h/d,每隔24h更換400ml營(yíng)養(yǎng)肉湯,三角燒瓶以水浴控制溫度在37℃,培養(yǎng)5～7d。1.2.2生物膜的識(shí)別1.2.2.物膜載體聚丙烯管縱向開(kāi)導(dǎo)率測(cè)定用無(wú)菌生理鹽水沖內(nèi)鏡模擬管腔,以去除管壁上未附著的浮游菌,用無(wú)菌手術(shù)刀片將生物膜載體聚四氟乙烯管縱向剖開(kāi)后,用無(wú)菌小棉簽擦拭剖面,將棉簽與聚四氟乙烯管片一并放入5mlPBS溶液的試管中,充分振蕩洗脫,將洗脫液經(jīng)適當(dāng)稀釋,選取適當(dāng)稀釋度接種平板,置37℃培養(yǎng)48h,計(jì)算單位面積上的菌落數(shù)(CFU/cm2)。1.2.2.酸緩沖液沖洗另取出經(jīng)過(guò)培養(yǎng)成熟的生物膜載體,聚四氟乙烯模擬管腔縱向剖開(kāi),在2.5%的戊二醛溶液中4℃固定過(guò)夜,倒掉固定液,用0.1mol/L,pH7.0的磷酸緩沖液漂洗3次,每次15min;用1%的鋨酸溶液固定1～2h;倒掉固定液,用0.1mol/L,pH7.0的磷酸緩沖液漂洗3次,每次15min;用梯度濃度:50%、70%、80%、90%和95%5種濃度的乙醇溶液進(jìn)行脫水處理,每種濃度處理15min,再用100%乙醇處理2次,每次20min。用乙醇與醋酸異戊酯的混合液(1∶1)處理30min,再用純醋酸異戊酯處理1～2h,經(jīng)二氧化碳臨界點(diǎn)干燥,離子濺射儀噴金鍍膜,掃描電鏡觀察生物膜情況。1.3生物膜載體表面細(xì)菌感染試驗(yàn)參照衛(wèi)生部2004年版《內(nèi)鏡清洗消毒技術(shù)規(guī)范》規(guī)定的內(nèi)鏡清洗程序,取16段(2cm/段)培養(yǎng)好的成熟生物膜聚四氟乙烯管載體分2組,同時(shí)完成水洗(1min)、不同清洗液清洗3min、次清洗1min3步驟。其中一組水洗過(guò)程中用內(nèi)鏡專用毛刷在管腔內(nèi)壁連續(xù)刷洗5次,另一組則不用毛刷刷洗。清洗液分別為無(wú)菌水、無(wú)酶清洗液(1∶200稀釋)、低濃度酶清洗液(1∶1000稀釋)、高濃度酶清洗液(1∶50稀釋)。完成清洗過(guò)程后,分別取出生物膜載體,其中一段將生物膜載體管縱向剖開(kāi),用無(wú)菌小棉簽擦拭剖面,使載體表面的細(xì)菌完全脫落進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),試驗(yàn)重復(fù)6次,除菌對(duì)數(shù)值=陽(yáng)性對(duì)照組菌濃度對(duì)數(shù)值-試驗(yàn)組菌濃度對(duì)數(shù)值,陽(yáng)性對(duì)照為PBS處理;另一段縱向剖開(kāi)后用25g/L戊二醛固定后,掃描電鏡觀察生物膜結(jié)構(gòu)變化。1.4生物膜細(xì)菌量的變化各組試驗(yàn)數(shù)據(jù),用Excel辦公軟件做曲線圖,分析生物膜細(xì)菌量變化情況;不同清洗方法效果比較選用SPSS18統(tǒng)計(jì)軟件,隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的方差分析,兩兩比較用Bonferroni法。2結(jié)果2.1生物膜細(xì)菌數(shù)的變化活菌計(jì)數(shù)結(jié)果表明,第1～3天,聚四氟乙烯管上生物膜細(xì)菌由103CFU/cm2增加至105CFU/cm2;第4～6天,聚四氟乙烯管生物膜內(nèi)細(xì)菌數(shù)維持在106CFU/m2取出已培養(yǎng)4d和6d的聚四氟乙烯管做簡(jiǎn)單水沖洗,經(jīng)結(jié)晶紫染色后,光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行比較觀察發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)4d的聚四氟乙烯管經(jīng)水沖洗后,內(nèi)壁上殘留細(xì)菌生物膜呈不規(guī)則散在,斑紋狀在內(nèi)壁上鋪開(kāi);培養(yǎng)6d形成的生物膜含菌數(shù)增長(zhǎng)穩(wěn)定,細(xì)菌之間的黏液絲將細(xì)菌連接形成致密的生物膜,不易沖洗脫落,至培養(yǎng)第7天生物膜菌量略有下降,見(jiàn)圖1、2。2.2清洗后生物膜效果觀察4種清洗方法的效果不同(F=342.710,P=0.000),進(jìn)一步經(jīng)兩兩比較,經(jīng)過(guò)外力刷洗后的高濃度酶清洗與專用無(wú)酶清洗液方法去除四氟乙烯管壁處存在的生物膜效果比較好。見(jiàn)表1。無(wú)菌水、加刷洗力后生物膜基本上未脫落見(jiàn)圖3、4;未刷洗低濃度酶作用和刷洗后低濃度酶作用后100倍電鏡下生物膜生物膜從管壁上微微剝落,但仍有大片生物膜存在。見(jiàn)圖5、6。在低倍電鏡下在加刷洗無(wú)酶清洗和多酶清洗明顯可看見(jiàn)脫落的生物膜。未刷洗無(wú)酶洗液作用后可見(jiàn)明顯的生物膜剝落,經(jīng)過(guò)刷洗后無(wú)酶作用存在管壁的生物膜已很少見(jiàn)。見(jiàn)圖7、8。未刷洗高濃度酶洗液作用后明顯可見(jiàn)生物膜開(kāi)始從管壁剝落,經(jīng)過(guò)刷洗后高濃度酶作用管壁也少見(jiàn)生物膜存在見(jiàn)圖9、10。3內(nèi)鏡管腔清洗的必要性曾有報(bào)道,臨床內(nèi)鏡管腔類器械上有65%的細(xì)菌性感染是由細(xì)菌生物膜所引起,分析原因有很多,主要可能是管道內(nèi)膜損壞或沉積物黏附、礦物質(zhì)堆積是導(dǎo)致清洗不盡,所殘留的血液、胃腸道黏液、其他有機(jī)物極易使各種細(xì)菌生長(zhǎng)、繁殖,形成細(xì)菌囊袋,導(dǎo)致細(xì)菌生物膜生長(zhǎng),一旦生物膜形成可降低消毒劑對(duì)細(xì)菌和病毒的穿透力和滅活作用,導(dǎo)致消毒失敗。根據(jù)近來(lái)疾控部門針對(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)的內(nèi)鏡診療場(chǎng)所的綜合調(diào)查顯示,盡管醫(yī)護(hù)人員消毒工作比較規(guī)范,但消毒質(zhì)量合格率較低,總體合格率只有30%～60%,且有銅綠假單胞菌生物膜分離出。本次研究試驗(yàn)選取銅綠假單胞菌為試驗(yàn)菌株,進(jìn)行體外培養(yǎng),并選用臨床內(nèi)鏡內(nèi)壁常用的材料聚四氟乙烯管為生物膜培養(yǎng)的載體,試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在掃描電鏡高倍鏡下可清晰看見(jiàn)濃密的黏液樣物質(zhì)緊密包繞著大量的短桿狀細(xì)菌,聚集成團(tuán)塊狀且不易脫落。我們采用了醫(yī)院目前使用的內(nèi)鏡專用無(wú)酶清洗液,內(nèi)鏡專用多酶清洗液,并以無(wú)菌水作為對(duì)照,模擬內(nèi)鏡管腔清洗效果發(fā)現(xiàn):(1)通過(guò)刷洗后的4組試驗(yàn)明顯的對(duì)數(shù)值下降,原因可能是通過(guò)無(wú)菌毛刷刷洗,能夠通過(guò)降低污染物與基底之間的黏著力而發(fā)揮作用,只有經(jīng)過(guò)明顯的外力作用才能有效清除生物膜的殘存。試驗(yàn)證明刷洗是內(nèi)鏡清洗去處生物膜必不可少的環(huán)節(jié),但目前臨床中往往對(duì)刷洗環(huán)節(jié)不夠重視,認(rèn)為好的消毒劑和清洗液才是清洗的關(guān)鍵。國(guó)外學(xué)者也認(rèn)為,只有通過(guò)正確的清洗步驟才能降低生物膜在內(nèi)鏡管道中形成的概率。(2)足夠濃度的多酶洗液才能清洗生物膜,筆者嘗試用最大使用濃度(1∶200)時(shí),發(fā)現(xiàn)只能去除生物膜約1個(gè)對(duì)數(shù)值,且臨床中目前真正使用一洗一換酶液的很少,重復(fù)使用降低了使用濃度。當(dāng)使用高濃度酶洗液時(shí),在高倍電鏡下觀察可見(jiàn),使用多酶洗液處理組,管壁殘留細(xì)菌上黏絲狀胞外基質(zhì)相對(duì)較少,說(shuō)明清洗中的酶對(duì)胞外基質(zhì)分解起一定作用。(3)無(wú)酶清洗液和多酶清洗液清洗效果二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,甚至無(wú)酶洗液效果略好于多酶洗液。曾有報(bào)道稱非含酶洗液優(yōu)于多酶洗液方法,認(rèn)為內(nèi)鏡專用的無(wú)酶洗液能夠通過(guò)降低污染物與基底之間的黏著力而發(fā)揮作用,而多酶清洗液則通過(guò)降低污染物內(nèi)部的黏著力而發(fā)揮作用。由于筆者并不知曉該洗液的真正清洗成分,所以未能通過(guò)試驗(yàn)了解去除生物膜機(jī)制。但通過(guò)預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該清洗液還能夠起到抑菌作用,提示是否是去除生物膜真正的原因還未知。本研究證實(shí)內(nèi)鏡管腔生物膜形成的條件,說(shuō)明日常清洗消毒的重要性,臨床發(fā)現(xiàn)清洗消毒總是不合格的內(nèi)鏡,應(yīng)采用正確的