克百威對蚯蚓的急性毒性及殘留量測定

克百威對蚯蚓的急性毒性及殘留量測定

克氏合金化學(xué)名稱2、3-二羥基-2、2-二甲基-7-苯并含有7-氨基丙烯酸，屬于氨基丙烯酸農(nóng)藥。國家登記可用于水稻、棉花、煙草、大豆等作物防治多種害蟲,也可專門用作種子處理劑使用。同時(shí),克百威也是丁硫克百威和丙硫克百威的一級降解產(chǎn)物,而丁硫克百威和丙硫克百威國家登記都可用于棉花、水稻等作物上防治多種害蟲,而丁硫克百威還可用于黃瓜、番茄、十字花科蔬菜等作物上。據(jù)前人研究,克百威在旱地土壤中的半衰期為30~60d,在水田中半衰期為1~2d,并且土壤性質(zhì)及環(huán)境因子都直接或間接的影響著其在土壤中的降解轉(zhuǎn)化,本試驗(yàn)選擇在同種土壤,相同條件下研究克百威的動態(tài)變化。蚯蚓是土壤中一種重要的生態(tài)環(huán)境指示生物,選擇其作為非靶標(biāo)生物。美國國家環(huán)保局(EPA)標(biāo)準(zhǔn)531.1及我國農(nóng)業(yè)部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T761—2008)規(guī)定了10種氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的分析測定方法,此方法采用高效液相色譜柱后衍生熒光檢測器檢測,具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、干擾小等優(yōu)點(diǎn),本文采用此法探索了不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)克百威在土壤中的動態(tài)變化。1材料和方法1.1儀器和試劑1.1.1儀器、試劑和儀器600E型高效液相色譜、柱后衍生反應(yīng)系統(tǒng)、試劑管理單元(美國Waters);Waters2475熒光檢測器,Empower色譜工作站;500mg/6mLNH2固相萃取小柱(美國Phenomenex);KL512型氮吹儀(北京康林科技有限責(zé)任公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI);恒溫振蕩器(常州澳華儀器有限公司);ABT220-5DM十萬分之一電子天平(德國科恩)。1.1.2標(biāo)準(zhǔn)母液的配制乙腈、甲醇、二氯甲烷、氯化鈉、無水硫酸鈉均為分析純(廣州化學(xué)試劑廠),140℃烘烤4h;液相色譜用甲醇、乙腈均為色譜純(美國FishierScientific);片狀氫氧化鈉(97%)、十水硼酸鈉(99.5%~105%)(英國AlfaAesar);鄰苯二甲醛(OPA)、2-巰基乙醇(ME)、克百威標(biāo)準(zhǔn)品99.9%(美國Sigma公司);97.8%克百威原藥(農(nóng)藥廠)。標(biāo)準(zhǔn)母液的配制用萬分之一天平準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品10mg,移入10mL容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,配制成1000mg/L的母液,保存冰箱中備用。液相柱后反應(yīng)試劑的配制0.05mol/L氫氧化鈉的配制:稱取2g片狀氫氧化鈉溶于1L水中,并用0.45μm濾膜過濾脫氣;制備衍生用OPA/ME試劑:稱取19.1g十水硼酸鈉攪拌溶于1L水中備用。溶解100mgOPA于10mL甲醇中并轉(zhuǎn)移至1L容量瓶中,用制備好的十水硼酸鈉溶液稀釋至刻度混合均勻。并用0.45μm濾膜過濾脫氣后加入400μL2-巰基乙醇混合均勻,一旦ME加入后切勿再脫氣,置于棕色儲液瓶中避光保存。1.2方法1.2.1溶劑與流速測試方法色譜柱WatersCarbamateAnalysis3.9mm×150mmColumn,流動相水-甲醇,柱溫30℃,進(jìn)樣量20μL,熒光檢測器激發(fā)波長330nm,發(fā)射波長465nm,柱后衍生試劑0.05mol/L氫氧化鈉(0.3mL/min),OPA試劑(0.3mL/min),反應(yīng)器溫度80℃,溶劑梯度與流速程序見表1。在此液相色譜條件下克百威的保留時(shí)間為19.765min。1.2.2新鮮土樣的制備試驗(yàn)土壤:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院中國熱帶植物園表層0~20cm的新鮮土樣,剔除殘根和石塊等雜質(zhì)物,過2mm篩子備用;供試蚯蚓:赤子愛勝蚓(天津蚯蚓養(yǎng)殖場)。1.2.3土壤的預(yù)處理供試蚯蚓的處理馴養(yǎng):蚯蚓運(yùn)回后放入已經(jīng)調(diào)過濕度的土壤中,每天補(bǔ)充水分保持土壤濕度在30%左右,并添加蚯蚓飼料馴化,待死亡率穩(wěn)定后方可使用。清腸:實(shí)驗(yàn)前挑選茁壯長度在8~10cm蚯蚓,用清水清洗干凈,放入鋪有濕潤濾紙的盤子中,用帶有氣孔的鋁箔封口,避光保存12h。供試土壤的處理試驗(yàn)前,將供試土壤于室溫下放置1周,并調(diào)整土壤濕度(20%左右)保證土壤添加完農(nóng)藥后濕度達(dá)到30%。稱取土壤326.17g(含水量20.97%)于500mL燒杯中,加藥并調(diào)整土壤含水率至30%,此時(shí)土壤共重350g。先通過預(yù)備試驗(yàn),設(shè)置克百威土壤中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0、7.418、14.835、22.253、29.670、44.505mg/kg,每個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)放入清腸后的蚯蚓10條,每個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)重復(fù)3次,用留有氣孔的保鮮膜將燒杯蒙上,避光25℃恒溫保存。分別在1、3、5、7、10、14d觀察記錄蚯蚓死亡情況并補(bǔ)充水分使土壤中水分保持一致,并用四分法取土壤樣品13.000g(相當(dāng)于10g干土),測定土壤中克百威的殘留量,空白土壤中未檢出克百威。1.2.4樣品的制備及凈化1)樣品的提取:稱量13.000g土樣(根據(jù)土壤含水率計(jì)算得出相當(dāng)于10g土壤干質(zhì)量)于50mL離心管中,加入30mL乙腈,恒溫振蕩1h后離心(1200r/min,10min)取上清液。再加入20mL乙腈重復(fù)以上步驟,合并2次濾液于另一50mL離心管中。將上清液傾入250mL分液漏斗中,加入50mL25%氯化鈉溶液,振蕩待分層,分液。水相重新放入250mL分液漏斗中,加入30mL乙腈萃取1次,振蕩靜置分層,分液。將2次有機(jī)相傾入100mL燒杯中,加入25g無水硫酸鈉(140℃烘烤1h),磁力攪拌20min,定性濾紙過濾,并用10mL乙腈分2次沖洗燒杯。濾液傾入1L梨形瓶內(nèi),并用少量乙腈沖洗燒杯傾于梨形瓶中,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干(旋蒸參數(shù):水浴溫度35℃,壓力130mPa)。用2mL甲醇-二氯甲烷(體積比1∶99)溶液,分2次將其洗出于2.5mL離心管中待凈化。2)樣品的凈化:連接好固相萃取裝置,移液管移取4mL甲醇-二氯甲烷(體積比1∶99)溶液預(yù)洗條件化;當(dāng)溶劑液面達(dá)到吸附層表面時(shí),立即加入待凈化溶液,并用15mL離心管收集洗脫液;加入2mL甲醇-二氯甲烷(體積比1∶99)溶液于2.5mL離心管后過柱,并重復(fù)1次。并收集洗脫液(大約6mL)。將洗脫液置于50℃氮吹儀上蒸發(fā)近干。并用色譜純甲醇定容2.5mL。過0.45μm濾膜,待測。1.2.5樣品前處理和hplc檢測用空白土壤樣品進(jìn)行3個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的添加回收試驗(yàn),使克百威在土壤中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.1、0.5、5mg/kg,按照上述方法進(jìn)行樣品前處理和HPLC檢測。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果評價(jià)方法的準(zhǔn)確度和精密度。2結(jié)果與分析2.1空小精度的測定按照上述色譜條件,待儀器穩(wěn)定后,采用峰面積外標(biāo)法進(jìn)行定量?？税偻悠芳皹?biāo)準(zhǔn)品色譜峰見圖1,得到克百威的保留時(shí)間在19.705min附近。將儲備液用甲醇稀釋成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1、2、5、10、15mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別進(jìn)樣測定,以峰面積y對標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量分?jǐn)?shù)x制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照上述色譜條件,每個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)至少進(jìn)樣3次,進(jìn)樣20μL,得到峰面積平均值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在試驗(yàn)質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍內(nèi),峰面積與質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)性,其線性方程為y=3752178.94x+596516.83,相關(guān)系數(shù)r=0.9998。2.2克百威回收率取未檢出克百威的空白土壤,做加標(biāo)回收試驗(yàn)。稱取相當(dāng)于10g干土的上述土壤,分別進(jìn)行3個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的添加回收試驗(yàn),每個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)重復(fù)3次,結(jié)果見表2。表明低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的回收率在96.7%~106.9%之間;中等質(zhì)量分?jǐn)?shù)的回收率在104.6%~108.4%之間;高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的回收率在88.3%~91.8%之間,變異系數(shù)在1.5%~4.3%之間,空白土壤樣品未檢出克百威,且此色譜條件下克百威色譜峰能與其他雜質(zhì)峰完全分離,因此該殘留提取檢測方法符合農(nóng)藥殘留分析要求。以3倍信噪比計(jì)算得到儀器對土壤中克百威的檢出限為0.01mg/kg,符合農(nóng)殘檢測要求。2.3克百威的降解和殘留物的殘留情況按試驗(yàn)設(shè)計(jì),克百威在土壤中的加藥量分別為7.418、14.835、22.253、29.670、37.088、44.505mg/kg,加藥并放入蚯蚓后間隔不同時(shí)間采樣進(jìn)行殘留量測定,測定結(jié)果見表3。試驗(yàn)結(jié)果表明:加藥1d后在土壤中的殘留量分別為3.410、5.437、7.790、10.928、12.770、14.801mg/kg?？税偻诜庞序球镜耐寥乐薪到馊匀惠^慢,在有蚯蚓存在的情況下的半衰期分別為13.72、28.29、23.18、16.74、18.99、17.03d。第14天的降解率分別為50.89%、71.47%、70.40%、58.81%、59.04%、54.21%。半衰期和降解率都呈現(xiàn)減小的趨勢。Melo等研究表明土壤中0.2479mg/L的克百威半衰期為10.04d。據(jù)前人研究,克百威在旱地土壤中的半衰期為30~60d,在水田中半衰期為1~2d。Can等研究了甲草胺在黏壤土中的施用質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10、100mg/kg的情況下,40周后土壤中的殘留物分別為48%和37%,進(jìn)一步研究得出施用質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過100mg/kg時(shí),殘留物殘留顯著降低。Felsot等研究發(fā)現(xiàn)甲草胺在土壤中施用質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于750mg/kg時(shí),土壤中脫氫酶能被抑制長達(dá)21d。這種差異的主要原因在于農(nóng)藥在土壤中的消解方式比較復(fù)雜,其半衰期受微生物、光照、濕度、pH值、動植物代謝、農(nóng)藥自身性質(zhì)及其在土壤中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)等因素有關(guān)。而低劑量組土壤中蚯蚓死亡率較低,蚯蚓活動也可能起到一定的降解作用。2.4克百威對關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于關(guān)于農(nóng)村第一所控制的培育工作所造成的毒性作用的模擬不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)克百威處理土壤后,分別在1、3、5、7、10、14d觀察土壤中蚯蚓的存活情況,得到不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)克百威對蚯蚓死亡率的影響曲線如圖2所示。結(jié)果表明試驗(yàn)初期(前3天)由于蚯蚓的個(gè)體差異,土壤中農(nóng)藥不可能完全混合均勻等原因,不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的克百威對土壤中蚯蚓的死亡率并沒有明顯規(guī)律。試驗(yàn)中觀察到蚯蚓染毒后呈現(xiàn)腐爛、斷裂,體型變粗變短,體表分泌出黃色液體,表明克百威對蚯蚓的生長、活動有顯著的抑制作用,并且能對蚯蚓的皮膚結(jié)構(gòu)造成損傷。這與史雅娟等的研究一致。土壤中蚯蚓死亡率在1~5d急劇上升,5d后死亡率穩(wěn)定。土壤中克百威對蚯蚓第5、7、10、14天的LC50值及95%置信區(qū)間見表4。克百威在土壤中屬中等毒性。3凈化效果的分析在實(shí)驗(yàn)條件下,儀器對土壤中克百威的最小檢出限為0.01mg/kg,分析方法靈敏度符合農(nóng)藥殘留測定要求。添加回收率試驗(yàn)中3個(gè)添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)的回收率在89.1%~106.4%之間,變異系數(shù)在1.5%~4.3%之間,分析數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度可靠,符合農(nóng)藥殘留檢測要求。本實(shí)驗(yàn)用氨基固相萃取小柱分離純化樣品,達(dá)到了較好的分離純化效果。色譜分析用高效