N-亞油酰酪氨酸誘導(dǎo)PC12細(xì)胞通過(guò)自噬抗氧化研究

成都醫(yī)學(xué)院學(xué)士學(xué)位論文（設(shè)計(jì)）2題目：N-亞油酰酪氨酸誘導(dǎo)PC12細(xì)胞通過(guò)自噬抗氧化目錄摘要Ⅰ關(guān)鍵詞ⅠAbstractⅡKeywordsⅡ前言11材料11.1PC12細(xì)胞11.2試劑11.3儀器22方法22.1細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組22.2細(xì)胞計(jì)數(shù)32.3免疫熒光32.3.1細(xì)胞鋪板32.3.2一抗及一抗前處理32.3.3孵育二抗及熒光拍照32.4免疫印跡（Westernblot）32.4.1細(xì)胞鋪板32.4.2細(xì)胞蛋白的提取32.4.3Westernblot實(shí)驗(yàn)的制膠42.4.4SDS電泳緩沖液的配制42.4.5電泳與切膠轉(zhuǎn)模42.4.6封閉42.4.7一抗孵育42.4.8二抗孵育42.4.9凝膠成像42.5細(xì)胞存活率檢測(cè)（MTT法）42.6數(shù)據(jù)處理43結(jié)果53.1CB2受體拮抗劑AM630逆轉(zhuǎn)NITyr的作用53.2NITyr對(duì)PC12細(xì)胞CB1和CB2蛋白的作用53.3NITyr對(duì)PC12細(xì)胞自噬蛋白ATG5、BCL-2的作用63.4NITyr對(duì)PC12細(xì)胞自噬蛋白Beclin1、LC3和ATG13表達(dá)的影響74討論9結(jié)論10參考文獻(xiàn)10致謝12誠(chéng)信說(shuō)明12

ⅠⅡN-亞油酰酪氨酸誘導(dǎo)PC12細(xì)胞通過(guò)自噬抗氧化摘要目的：探討了N-亞油酰酪氨酸（N-iminoylTyrosine，NITyr）對(duì)氧化損傷的PC12細(xì)胞產(chǎn)生的自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1、ATG5、ATG13和抗細(xì)胞凋亡蛋白BCL-2表達(dá)量的影響，從而研究NITyr能否誘導(dǎo)PC12細(xì)胞通過(guò)自噬抗氧化損傷。方法：通過(guò)過(guò)氧化氫損傷誘導(dǎo)PC12細(xì)胞建立氧化損傷模型，分別加入CB1和CB2受體抑制劑觀察是否逆轉(zhuǎn)NITyr對(duì)細(xì)胞活力的作用，采用Westernblot和免疫熒光方法測(cè)定自噬相關(guān)蛋白（LC3、Beclin1、ATG5、ATG13和BCL-2）的表達(dá)以及CB1和CB2的蛋白表達(dá)。結(jié)果：CB1受體抑制劑AM251不能逆轉(zhuǎn)NITyr對(duì)細(xì)胞活力的作用，而CB2受體抑制劑AM630能逆轉(zhuǎn)NITyr的作用，且NITyr能抑制CB2受體蛋白的表達(dá)，但對(duì)CB1受體無(wú)作用。在氧化損傷環(huán)境中，細(xì)胞中總的LC3、Beclin1、ATG5、BCL-2和ATG13蛋白表達(dá)下調(diào)；NITyr在1μmol/L和5μmol/L濃度下能上調(diào)上述蛋白。且不同蛋白在三種濃度（0.5、1和5μmol/L）NITyr作用下，其表達(dá)水平高低不同，1μM濃度下作用最佳。結(jié)論：NITyr能通過(guò)誘導(dǎo)氧化損傷的PC12細(xì)胞自噬，使自噬相關(guān)蛋白表達(dá)增加，從而發(fā)揮抗氧化作用，此過(guò)程可能與CB2受體有關(guān)。關(guān)鍵詞N-亞油酰酪氨酸；自噬；氧化損傷；大麻素受體N-iminoylTyrosineInducesAntioxidationofPC12CellsthroughautophagyAbstractObjective:TostudytheeffectsofN-iminoyltyrosine(NITyr)ontheexpressionofautophagy-relatedproteinsLC3,Beclin1,ATG5,ATG13andBCL-2inoxidativedamagedPC12cells,soastoinvestigatewhetherNITyrcaninducePC12cellstooxidativedamagethroughautophagy.Methods:ToestablishtheoxidativedamagemodelofPC12cellsinducedbyhydrogenperoxide,andCB1andCB2receptorinhibitorswereaddedtoobservewhethertheycouldreversetheeffectofNITyroncellviability.Thentheexpressionofautophagy-relatedproteins(LC3,Beclin1,ATG5，ATG13andBCL-2)andtheexpressionofCB1andCB2weredeterminedbyWesternblotandimmunofluorescence.Results:CB1receptorinhibitorAM251couldnotreversetheeffectofNITyroncellviability,whileCB2receptorinhibitorAM630couldreversetheeffectofNITyr,andNITyrcouldinhibittheexpressionofCB2receptorprotein,buthadnoeffectonCB1receptor.Inoxidativedamageenvironment,thetotalexpressionofLC3,Beclin1,ATG5,BCL-2andATG13wasdown-regulated,andNITyrcouldup-regulatetheseproteinsat1and5μMmol/Lconcentrations.Theexpressionlevelsofdifferentproteinsweredifferentunderthreeconcentrations(0.5,1and5μMmol/L)ofNITyr,andtheeffectof1μMwasthebest.Conclusions:NITyrcanincreasetheexpressionofautophagy-relatedproteinsbyinducingautophagyofoxidativedamagedPC12cells,thusexertingantioxidanteffect.ThisprocessmayberelatedtoCB2receptor.KeyWordsN-iminoylTyrosine;autophagy;oxidativedamage;Cannabinoidreceptor1前言在體內(nèi)有害因素刺激下，機(jī)體發(fā)生的體內(nèi)自由基增加或抗氧化保護(hù)能力減弱，致氧化和抗氧化系統(tǒng)平衡的失調(diào)。在此狀態(tài)下過(guò)多積累的活性氧，會(huì)造成核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物分子的損傷，進(jìn)而導(dǎo)致心血管疾病、慢性退行性疾病諸如阿爾茨海默癥（Alzheimersdisease,AD）或帕金森癥等的發(fā)生和發(fā)展。細(xì)胞中的氧化和抗氧化系統(tǒng)平衡的失調(diào)是氧化應(yīng)激造成細(xì)胞損傷的一個(gè)原因，該過(guò)程產(chǎn)生的活性氧亦是細(xì)胞發(fā)生自噬的一個(gè)誘因，受損的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器可通過(guò)自噬降解，從而緩解損傷，保護(hù)細(xì)胞，所以自噬和氧化應(yīng)激之間相互影響。抗氧化劑可通過(guò)中和自由基、消除或防止氧化劑轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘愿鼜?qiáng)的化合物，減緩或抑制細(xì)胞損傷，達(dá)到抗氧化的目的［1］。細(xì)胞自噬是真核細(xì)胞處理自身產(chǎn)生的受損壞的蛋白和細(xì)胞器等生物大分子的過(guò)程。正常生理下，細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的維持只需要少量的自噬，但在細(xì)胞內(nèi)外刺激（如營(yíng)養(yǎng)缺乏、低氧［2］、小分子化合物和激素［3］等）誘導(dǎo)作用下，細(xì)胞大量自噬的形成則由細(xì)胞信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)。越來(lái)越多研究結(jié)果提示，機(jī)體的全身腫瘤［4］、神經(jīng)退行性疾?。?］、和心臟疾病等的發(fā)生發(fā)展和治療均與細(xì)胞的自噬不足或過(guò)量自噬有關(guān)。囊泡核化的激活由應(yīng)激信號(hào)觸發(fā)，從而形成自噬，在此階段，由雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin，mTOR）和Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶復(fù)合物兩種激酶發(fā)揮重要作用［6］。而自噬相關(guān)蛋白（autophagy-relatedprotein,Atg）ATG13、ATG5、Beclin1、LC3控制自噬的延伸［7］；在正常機(jī)體環(huán)境下，自噬形成的抑制是由抑制細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2家族與Beclin1結(jié)合誘導(dǎo)的［8-9］，而在其他壓力下，Beclin1可脫離Bcl-2的束縛釋放后，發(fā)揮自噬功能［10］?，F(xiàn)有研究證實(shí)，內(nèi)源性大麻素（主要成分為：花生四烯酸乙醇胺（Anandamide，AEA））能通過(guò)抗氧化，抑制自由基形成、減少細(xì)胞鈣內(nèi)流、抗炎作用和神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育調(diào)節(jié)等機(jī)制發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。但其存在多種局限性，如作用廣泛，副作用較多，靶器官濃度較低等，較難維持基本活性［11］。因此，基于AEA化學(xué)結(jié)構(gòu)，實(shí)驗(yàn)室對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，自主合成其類(lèi)似物N-亞油酰酪氨酸（N-iminoylTyrosine，NITyr），再因目前無(wú)此類(lèi)化合物用于神經(jīng)退行性疾病的的研究報(bào)道，所以，探究其是否誘導(dǎo)氧化損傷的細(xì)胞自噬從而抗氧化，對(duì)研究與AD的關(guān)系具有重要價(jià)值。材料1.1PC12細(xì)胞大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤（ratpheochromocytoma,PC12）細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。試劑試劑名稱(chēng)生產(chǎn)廠家高糖型DMEM培養(yǎng)液Hyclone公司胰蛋白酶溶液Hyclone公司磷酸鹽緩沖液（PBS）Hyclone公司胎牛血清（FBS）北京全式金生物公司青鏈霉素混合溶液BCA蛋白定量試劑盒過(guò)氧化氫（H2O2）TritonX-100牛血清白蛋白（BSA）Tris、吐溫-20甘氨酸（Glycine）丙烯酰胺北京全式金生物公司北京全式金生物公司成都金山化學(xué)試劑有限公司德國(guó)BioFroxx公司德國(guó)BioFroxx公司德國(guó)BioFroxx公司德國(guó)BioFroxx公司上海阿拉丁生物科技公司多聚甲醛甲叉雙丙烯酰胺成都市科龍化工試劑廠成都市科龍化工試劑廠過(guò)硫酸銨（APS）十二烷基硫酸鈉（SDS）四甲基乙二胺（TEMED）DAPI蛋白酶抑制劑RIPA裂解液廣譜彩虹預(yù)染蛋白markerPVDF膜化學(xué)發(fā)光底物Beclin1、LC3、ATG5、CB1兔單克隆一抗GAPDH兔多克隆抗體CB2兔單克隆抗體BCL-2、ATG13兔單克隆一抗AlexaFluor594標(biāo)記的山羊抗兔二抗HRP標(biāo)記的山羊抗鼠/兔二抗CB1抑制劑AM251CB2抑制劑AM630噻唑藍(lán)粉末（MTT）蓋玻片、載玻片成都市科龍化工試劑廠成都市科龍化工試劑廠Bioworld公司上海碧云天生物研究所上海碧云天生物研究所上海碧云天生物研究所北京康為世紀(jì)生物科技美國(guó)Millipore公司美國(guó)Millipore公司美國(guó)proteintech公司美國(guó)proteintech公司美國(guó)caymanchemical公司成都正能生物公司美國(guó)Abways公司美國(guó)Abways公司美國(guó)Selleckchemical美國(guó)Sigma公司上海源葉江蘇世泰公司儀器儀器名稱(chēng)生產(chǎn)廠家超凈工作臺(tái)美國(guó)ThermoFisherScientific公司CO2培養(yǎng)箱臺(tái)式冷凍離心機(jī)Kdc-40低速離心機(jī)流式細(xì)胞儀6/96孔細(xì)胞培養(yǎng)板電子天平BX63正置熒光顯微鏡酶標(biāo)儀Westernblot電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀ChemiDoc化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀美國(guó)ThermoFisherScientific公司美國(guó)ThermoFisherScientific公司中國(guó)中佳公司中國(guó)艾森公司中國(guó)NEST賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司日本Olympus公司美國(guó)BioTek公司美國(guó)Bio-Rad公司美國(guó)Bio-Rad公司步驟2.1細(xì)胞的培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組PC12細(xì)胞用含10%的胎牛血清和1%的雙抗的高糖型DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)于37℃、5%CO2的CO2培養(yǎng)箱中，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組如下：①control組（DMEM培養(yǎng)基）；②氧化損傷模型組（500μMH2O2）；③0.5μMNITyr+氧化損傷組；④1μMNITyr+氧化損傷組；⑤5μMNITyr+氧化損傷組。2.2細(xì)胞計(jì)數(shù)（1）倒掉已培養(yǎng)PC12細(xì)胞兩天的培養(yǎng)基，用1XPBS搖洗2-3次，倒盡殘余液體，1mL移液槍加入1mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化1-2min后，5mL移液槍加入2mL含5%FBS的培養(yǎng)基終止消化，防止細(xì)胞因過(guò)度消化死亡，吹落貼壁的細(xì)胞使其全部懸浮；（2）吸出細(xì)胞懸液至15mL離心管中；設(shè)置離心機(jī)轉(zhuǎn)速為1338rpm，離心時(shí)間5min，并配平，離心；倒掉離心后的液體，加入1mL含10%FBS的培養(yǎng)基，吹打混勻；96孔板單孔加入180μLPBS，取20μL細(xì)胞懸液與PBS混合，采用Quanteen流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)。2.3免疫熒光2.3.1細(xì)胞種板細(xì)胞鋪板前12h用75%乙醇浸泡22*22mm蓋玻片，試驗(yàn)時(shí)，將潔凈且干燥的蓋玻片置于六孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度為20*104/mL后，1mL移液槍吸取1mL至每孔內(nèi)，搖動(dòng)六孔板，使細(xì)胞懸液均勻覆蓋整個(gè)孔，避免細(xì)胞貼壁后分布不均勻，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h；1mL移液槍貼壁吸出培養(yǎng)PC12細(xì)胞24h后的培養(yǎng)基，再加1mLPBS搖洗細(xì)胞2次，加入提前配好的藥，1mL/孔,細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h。2.3.2一抗及一抗前處理（1）1mL移液槍貼壁吸出六孔板中上懸液后，加入PBS浸洗細(xì)胞3次*3min；（2）每孔加入1mL4%的多聚甲醛，15min后吸出，加入PBS浸洗細(xì)胞3次*3min；（3）每孔加入1mL提前配好的0.5%TritonX-100(1XPBS配制)，室溫下靜置20min，目的是使細(xì)胞膜通透；吸出通透液，每孔加入1mLPBS，吸取殘留TritonX-100，重復(fù)浸洗3次*3min；（4）用不易掉紙屑的干凈濾紙吸干板中殘留PBS，每孔輕滴加1mL5%BSA（1XTBST配制），輕搖晃培養(yǎng)板以均勻分布，室溫下靜置封閉30min；（5）回收封閉液5%BSA，干凈濾紙吸干殘余封閉液，每孔輕滴加600μL稀釋好的一抗（含1%BSA的TBST配制，稀釋比例Beclin1、LC3、BCL-2、ATG5為1:600，ATG13為1:500）在蓋玻片上，確保每一處細(xì)胞都能接觸到一抗，4℃冰箱靜置孵育過(guò)夜。2.3.3孵育二抗及熒光拍照（1）1mL移液槍充分吸出一抗，并做好回收，每孔加入1mL1XTBST浸洗爬片3次，3min/次，干凈濾紙吸干孔中殘余液體后，六孔板水平放置，蓋玻片上輕滴加稀釋好的AlexaFluor594標(biāo)記的二抗（含1%BSA的TBST配制，稀釋比例1:1000），室溫避光（20-37℃）靜置孵育1h，回收二抗，TBST浸洗爬片3次，5min/次；（2）復(fù)染核：滴加提前配好的DAPI染液（1μg/mL,RO水配制）避光靜置孵育5min，TBST5min*4次洗去殘留的DAPI染液；（3）蓋玻片（有細(xì)胞面向上）放于洗凈且干燥的載玻片上，采用BX63正置熒光顯微鏡觀察好細(xì)胞圖像后，采集圖像，在10倍、20倍、40倍物鏡下均采集圖像。2.4免疫印跡（Westernblot）2.4.1細(xì)胞鋪板培養(yǎng)方式和加藥分組同2.3.1，僅調(diào)整細(xì)胞鋪板密度為100*104/mL。2.4.2細(xì)胞蛋白的提取給藥處理完畢后，PBS浸洗細(xì)胞3次*3min，單孔加入200μL已配好的裂解液（RIPA裂解液：蛋白酶抑制劑=100：1），輕搖六孔板，目的是足夠多的細(xì)胞能接觸裂解液，保證總蛋白量滿足實(shí)驗(yàn)需求，六孔板靜置于冰上裂解細(xì)胞20min，利用刮刀刮下貼壁細(xì)胞，200μL移液槍吸出孔中全部液體至1.5mLEP管中，冰上繼續(xù)裂解10min。將樣品置于提前預(yù)冷為4℃的臺(tái)式冷凍離心機(jī)中，配平放置，設(shè)置離心參數(shù)離心力12000g，離心時(shí)間20min后離心；完畢后，輕拿輕放樣品，以避免已沉淀的細(xì)胞碎片混在蛋白中，吸取離心后的上清液至相應(yīng)1.5mLEP管中（后續(xù)步驟均在冰上操作），按照BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，以及樣品的定量，使所有樣品滿足60μg/20μL的上樣量，用于檢測(cè)。2.4.3Westernblot實(shí)驗(yàn)的制膠（1）配制不同濃度分離膠（BCL-2、Beclin1和LC3采用12%分離膠，ATG5和ATG13采用8%分離膠），30%丙烯酰胺、10%SDS、1.5MTris-HClPH8.8、RO水混勻后，再依次加入10%的過(guò)硫酸銨和TEMED,混勻。（2）5mL移液槍加入分離膠到玻板四分之三處，立即加入適量異丙醇?jí)耗z，待膠在室溫下凝固后，倒掉異丙醇，用RO水沖洗殘留異丙醇3次，再盡量晾干RO水。（3）5%濃縮膠的制備：根據(jù)薄板膠的個(gè)數(shù)確定試劑體積，30%丙烯酰胺、1MTris-HClPH6.8、10%SDS、RO水混勻后，加入10%的過(guò)硫酸銨和TEMED，混勻。（4）1mL移液槍加入濃縮膠，立即插入梳子，待濃縮膠凝固，過(guò)程中切忌產(chǎn)生氣泡。2.4.4SDS電泳緩沖液的配制電子天平稱(chēng)量Tris7.55g、Glycine47.0g、SDS2.5g，量取400mLRO水溶解后，再定容至500mL的5X電泳緩沖液。用前稀釋至1X后即可使用。2.4.5電泳與切膠轉(zhuǎn)模2μLMarker和20μL提取的蛋白，按順序加入孔后；安裝電泳儀，先用80V的恒壓電泳，等到蛋白及marker到達(dá)分離膠時(shí)，然后換成120V的電壓，等樣品中溴酚藍(lán)電泳至距離玻板底部約1cm處時(shí)，結(jié)束電泳。以Marker蛋白條帶為準(zhǔn)，切下對(duì)應(yīng)分子量大小的目的條帶，剪裁比膠稍大的PVDF膜（用前甲醇活化1min），安裝膜轉(zhuǎn)儀，注意膜與膠之間不能有氣泡，且安裝順序要正確，轉(zhuǎn)膜槽中放入冰袋，加入轉(zhuǎn)膜液使其剛好浸沒(méi)轉(zhuǎn)膜夾，調(diào)節(jié)電流為250mA，轉(zhuǎn)膜90min。2.4.6封閉孵育盒中加入能浸沒(méi)PVDF膜的5%BSA封閉液（1XTBST配制），將含蛋白面的PVDF膜向下放置后，將孵育盒置于37℃恒溫?fù)u床上封閉1h。封閉完成后將含蛋白面的PVDF膜向上放置（后續(xù)操作均向上），回收5%BSA，用1XTBST搖床上搖洗3次*5min，移液槍吸干殘余液體。2.4.7一抗孵育將相應(yīng)目的蛋白和GAPDH的PVDF膜置于已稀釋好的相應(yīng)一抗（含1%BSA的TBST稀釋?zhuān)♂尡壤?:1000）中，4℃搖床上孵育19-20h，做好一抗的回收，用1XTBST搖洗PVDF膜15min。2.4.8二抗孵育加入與一抗對(duì)應(yīng)來(lái)源的HRP標(biāo)記的二抗（含1%BSA的TBST稀釋?zhuān)♂尡壤?：10000），室溫下?lián)u床孵育1h，吸出二抗，并做好回收標(biāo)記回收，用1XTBST搖床上搖洗PVDF膜3次*5min。2.4.9凝膠成像PVDF膜上滴加適量已配制好的化學(xué)發(fā)光底物（A液：B液=1:1），采用化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（美國(guó)BioRad公司）曝光成像。2.5PC12細(xì)胞存活率的檢測(cè)（MTT法）96孔板中接種密度為5*104/100μL的PC12細(xì)胞，37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h；按下列實(shí)驗(yàn)分組給藥處理細(xì)胞24h：①control組；②模型組；③1μMNITyr+500μMH2O2組；④3μMAM251+1μMNITyr+500μMH2O2組；⑤3μMAM251+500μMH2O2組；⑥3μMAM630+1μMNITyr+500μMH2O2組；⑦3μMAM630+500μMH2O2組；給藥處理后，每孔加入10μL已配好的MTT，在37℃，孵育6h，完成后吸出每孔液體，棄去。再向每孔加入100μL的DMSO，立即用振蕩器振蕩10min，采用酶標(biāo)儀（490和560nm）測(cè)定吸光度（OD），按細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組OD值/control組OD值*100%計(jì)算。2.6數(shù)據(jù)處理所得數(shù)據(jù)均用mean±SD表示。組間比較采用ANOVA分析，組間兩兩比較采用Dunnett’sT3檢測(cè)。P<0.05為顯著性差異，P<0.01為非常顯著性差異，P<0.001為極顯著性差異。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用GrapdPrism5.0軟件。結(jié)果3.1CB2受體拮抗劑AM630逆轉(zhuǎn)NITyr的作用如圖1如示，與control組相比，H2O2組能明顯降低PC12細(xì)胞活力，具有顯著性差異（P<0.01），1μMNITyr能逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象。CB1受體拮抗劑AM251不能逆轉(zhuǎn)NITyr作用，無(wú)顯著性差異，而CB2受體拮抗劑AM630能逆轉(zhuǎn)NITyr的作用，具有顯著性差異（P<0.05）。圖1NITyr,AM251和AM630對(duì)細(xì)胞活力的作用*：P<0.05，**：P<0.01vsH2O2,#：P<0.05vsNITyr.3.2NITyr對(duì)PC12細(xì)胞CB1和CB2蛋白的作用如圖2所示，與control組相比，H2O2組能明顯降低CB1的蛋白表達(dá)，具有非常顯著性差異（P<0.01）；與H2O2組比較，NITyr不能上調(diào)PC12細(xì)胞CB1蛋白的表達(dá)，無(wú)顯著性差異。與control組相比，H2O2組能明顯使CB2蛋白表達(dá)上調(diào)，具有顯著性差異（P<0.01）；與H2O2組比較，NITyr能下調(diào)PC12細(xì)胞CB2的蛋白表達(dá)，具有顯著性差異（P<0.05）。圖2NITyr對(duì)細(xì)胞CB1和CB2蛋白表達(dá)的作用*：P<0.05，**：P<0.01vsH2O23.3NITyr對(duì)PC12細(xì)胞自噬蛋白ATG5、BCL-2的作用如圖3所示，與control組相比，H2O2組能明顯降低ATG5和BCL-2的表達(dá)，具有顯著性差異（P<0.01）；與H2O2組比較，NITyr(濃度為1μM和5μM)可上調(diào)PC12細(xì)胞自噬蛋白ATG5、BCL-2的表達(dá)水平，具有顯著性差異（P<0.05），0.5μM濃度下無(wú)作用。通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與control組比較，H2O2組藍(lán)光弱即細(xì)胞數(shù)量少，細(xì)胞核皺縮，紅光弱即ATG5和BCL-2蛋白表達(dá)減少，1和5μM的NITyr能逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象。（圖3A-E）。ABCDE圖3NITyr對(duì)H2O2損傷的PC12細(xì)胞自噬蛋白ATG5和BCL-2表達(dá)的影響.采用Westernblot(A-C)和免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞ATG5和BCL-2（紅色）表達(dá)水平，細(xì)胞核（藍(lán)色）采用DAPI染液染色（D-E）。（A）：免疫印跡法檢測(cè)得到的ATG5和BCL-2的表達(dá)水平。GAPDH用作內(nèi)參抗體。（BandC）：TheintensityofATG5(B)andBCL-2(C).*：P<0.05，**：P<0.01vsH2O2.3.4NITyr對(duì)PC12細(xì)胞自噬蛋白Beclin1、LC3和ATG13表達(dá)的影響經(jīng)Westernblot和免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果顯示，與control組比較，H2O2組能明顯降低Beclin-1和ATG13的蛋白水平，具有顯著性差異（P<0.01，P<0.001）。在1μM和5μM的NITyr的保護(hù)下，與H2O2組比較，Beclin1蛋白表達(dá)上調(diào)，具有顯著性差異（P<0.05）（圖4B，圖5A）。自噬蛋白LC3如圖4C、圖5B結(jié)果顯示,與control組相比，模型組LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值有下降趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異，提示H2O2未對(duì)PC12細(xì)胞LC3蛋白表達(dá)有明顯影響，與H2O2組比較，0.5μMNITyr組LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值減小，具有顯著性差異（P<0.05），1μMNITyr和5μMNITyr組LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值進(jìn)一步減少，LC3-Ⅱ表達(dá)明顯上調(diào)，具有顯著性差異（P<0.01）,提示暴露于H2O2損傷下的PC12細(xì)胞在給予NITyr保護(hù)后，NITyr可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。自噬蛋白ATG13如圖4D、圖5C結(jié)果顯示，與control組比較，H2O2組能明顯降低ATG13的表達(dá)，具有顯著性差異（P<0.001），與H2O2組比較，0.5μM和1μMNITyr可上調(diào)ATG13蛋白表達(dá)水平，具有顯著性差異（P<0.05，P<0.01），0.5μMNITyr無(wú)此作用。通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與control組比較，H2O2組藍(lán)光弱即細(xì)胞數(shù)量少，細(xì)胞核皺縮，紅光弱即Beclin1、LC3和ATG13蛋白表達(dá)減少，1和5μM的NITyr能逆轉(zhuǎn)上述現(xiàn)象。以上結(jié)果表明，NITyr可誘導(dǎo)H2O2損傷的PC12細(xì)胞自噬，從而抗氧化損傷。ABCD圖4NITyr對(duì)H2O2損傷的PC12細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3及ATG13的影響實(shí)驗(yàn)分為5組，分別為：control組：DMEM培養(yǎng)基；H2O2組：細(xì)胞在含500μMH2O2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；NITyr+H2O2組：細(xì)胞在含三種濃度（0.5μM、1μM、5μM）的NITyr和500μMH2O2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；細(xì)胞培養(yǎng)24h后，采用Westernblot法檢測(cè)Beclin1、LC3和ATG13蛋白的表達(dá)(A-D).（A）：ThelevelsofBeclin1,LC3andATG13weredeterminedbywesternblottinganalysis.GAPDH用作內(nèi)參抗體。（B,CandD）：TheintensityofBeclin1(B),LC3(C)andATG13(D).*：P<0.05，**：P<0.01vsH2O2.ABC圖5NITyr對(duì)H2O2損傷的PC12細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3及ATG13的影響采用免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞Beclin1、LC3和ATG13（紅色）表達(dá)水平，細(xì)胞核（藍(lán)色）采用DAPI染液染色（A-C）。討論AEA具有較好的抗氧化作用，但是半衰期短，不利于應(yīng)用，因此基于AEA的結(jié)構(gòu)，合成了AEA類(lèi)似物NITyr，而目前國(guó)內(nèi)外尚未有NITyr的抗氧化研究，故本課題以H202建立氧化損傷模型，以研究NITyr是否有抗氧化作用，及其抗氧化的作用機(jī)制。目前常用抗氧化的模型法主要有化學(xué)法、動(dòng)物模型法和細(xì)胞模型法，其中細(xì)胞模型法既能準(zhǔn)確模擬體內(nèi)環(huán)境，又能研究體內(nèi)外物質(zhì)對(duì)細(xì)胞氧化損傷的效果和機(jī)制，故優(yōu)勝于化學(xué)法的專(zhuān)屬性差，動(dòng)物模型法的試驗(yàn)周期長(zhǎng)、成本高［1］?；谖墨I(xiàn)報(bào)道有六味地黃丸［12］、川芎嗪［13］和桔梗多糖［14］等研究了H2O2可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化損傷，故本課題建立了H2O2氧化損傷模型,探討了NITyr對(duì)H2O2引起的細(xì)胞損傷的作用。本研究利用H2O2刺激PC12細(xì)胞建立模型，發(fā)現(xiàn)NITyr在1μM即能提高細(xì)胞活力，同時(shí)加入大麻素受體1的拮抗劑AM251不能逆轉(zhuǎn)NITyr作用，而用大麻素受體2拮抗劑AM630能逆轉(zhuǎn)上述作用。表明NITyr可能通過(guò)CB2受體達(dá)到抗氧化作用。CB1受體主要分布于腦、脊髓和外周神經(jīng)系統(tǒng)，主要參與記憶、認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)控制的調(diào)節(jié)。而CB2受體主要分布在外周系統(tǒng)，且主要來(lái)源于免疫細(xì)胞主要參與調(diào)節(jié)免疫作用。但，近年來(lái)也發(fā)現(xiàn)CB2受體參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的調(diào)控。其中內(nèi)源性大麻素的生物活性如抗氧化、抗炎、神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育調(diào)節(jié)的發(fā)生，研究證實(shí)是其結(jié)合和激活內(nèi)源性大麻素受體，從而調(diào)節(jié)情緒、記憶、自主神經(jīng)活動(dòng)等。以上實(shí)驗(yàn)表明，NITyr有可能是與CB2受體結(jié)合或者激動(dòng)CB2受體達(dá)到抗氧化作用，是否直接激動(dòng)在以后實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步開(kāi)展。阿爾茲海默癥，早期多認(rèn)為其誘因是基于膽堿能神經(jīng)假說(shuō)，而目前更多人更傾向于神經(jīng)元有毒物質(zhì)積聚如Aβ大量積聚，Tau過(guò)度磷酸化、自噬異?；虿蛔闶瞧湔T因［15］。自噬的形成包含誘導(dǎo)、囊泡的核化和延伸、及自噬體形成三大階段［16］，受mTOR調(diào)控的自噬過(guò)程，在其mTOR被抑制時(shí)，可上調(diào)自噬標(biāo)記因子如Beclin1、LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ、ATG5/7等誘導(dǎo)自噬［15］，目前在AD患者發(fā)現(xiàn)mTOR被抑制對(duì)改善AD癥狀有一定作用［17］。在囊泡核化和延伸階段亦需要ATG5/7和LC3蛋白的參與。自噬形成時(shí)，胞漿型LC3被酶切形成細(xì)胞質(zhì)LC3-Ⅰ，發(fā)生泛素樣反應(yīng)，轉(zhuǎn)變?yōu)樽允审w膜型LC3-Ⅱ,所以自噬水平的高低可由LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ的比值大小來(lái)估計(jì)。經(jīng)Westernblot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小劑量NITyr處理H2O2損傷的PC12細(xì)胞后，LC3-I/LC3-II的比值有減小的趨勢(shì)，LC3-1的蛋白表達(dá)減少而LC3-II蛋白表達(dá)增加，但無(wú)顯著性差異，表明機(jī)體為了清除活性氧自噬增加，但是增加的自噬還不足以抵御氧化應(yīng)激引起的損傷。加入稍大劑量NITyr后能明顯進(jìn)一步減小LC3-I/LC3-II的比值，表明NITyr能引起自噬增強(qiáng)達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的作用。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，Beclin1、Bcl-2、ATG5和ATG13的蛋白表達(dá)水平在NITyr的作用下顯著增加，提示NITyr可能經(jīng)mTOR介導(dǎo)細(xì)胞自噬，對(duì)PC12細(xì)胞起抗氧化作用。結(jié)論以上研究結(jié)果表明，NITyr能通過(guò)CB2受體抑制H2O2引起的PC12細(xì)胞氧化損傷，此過(guò)程可能與增強(qiáng)自噬過(guò)程有關(guān)，提示NITyr誘導(dǎo)細(xì)胞自噬可能在抗氧化損傷中有一定的研究?jī)r(jià)值。參考文獻(xiàn)[1]何方婷,陳嘉熠,徐佳伊等.氧化應(yīng)激細(xì)胞模型建立的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技,2019,40(07):341-345.[2]MazureNM,JacquesPouysségur.Hypoxia-inducedautophagy:celldeathorcellsurvival?[J].CurrentOpinioninCellBiology,2010,22(2):177-180.[3]鄭祖國(guó),張?jiān)u滸.細(xì)胞自噬形成機(jī)制及其功能研究進(jìn)展[J].中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào),2016,38(12):1541-1548.[4]BaekKH,ParkJ,ShinI.Autophagy-regulatingsmallmoleculesandtheirtherapeuticapplications[J].ChemicalSocietyReviews,2012,41(8):3245.[5]CuervoAM,BergaminiE,BrunkUT,etal.AutophagyandAging:TheImportanceofMaintaining"Clean"Cells[J].Autophagy,2005,1(3):131-140.[6]國(guó)海東,國(guó)海光,邵水金.自噬在阿爾茨海默病中的作用及其機(jī)制[J].生理科學(xué)進(jìn)展,2011,42(05):398-401.[7]許國(guó)平,楊鵬,祁宏.B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