實(shí)驗(yàn)3：細(xì)菌的分離與純化

實(shí)驗(yàn)3微生物的純種分離培養(yǎng)微生物廣泛地分布在自然界的土樣、水體、空氣、動(dòng)植物體表及人體、動(dòng)物體的排泄物中。它們以單個(gè)的菌體、無(wú)性孢子和芽孢的形式存在。由于單一的自然界環(huán)境并不能完全滿(mǎn)足微生物對(duì)水、空氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、溫度、pH的綜合要求，它們往往以散居”的狀態(tài)出現(xiàn)，而不能形成人們?nèi)庋劭芍苯佑^(guān)察到菌落。不同的自然環(huán)境中，微生物的種類(lèi)和數(shù)量差異很大。肥沃的土壤，富養(yǎng)化的水體，是許多微生物麇集、孳生的場(chǎng)所，在這里存活著能分解淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪、纖維素、木質(zhì)素、果膠、農(nóng)藥、含磷有機(jī)物（卵磷脂、肌醇、核酸等）、石油以及溶解銅礦的細(xì)菌、放線(xiàn)菌、真菌等多種類(lèi)的微生物，如何根據(jù)微生物的生理要求，按照人類(lèi)的需求，將它們從自然界中分離出來(lái)，獲得純種，發(fā)揮微生物的特長(zhǎng)為人類(lèi)的生產(chǎn)和生活服務(wù)，是微生物研究中最基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?．學(xué)會(huì)將混雜的各種微生物分離成純種，統(tǒng)計(jì)分析樣品中微生物的種類(lèi)和數(shù)量的方法。2．學(xué)會(huì)從菌落及培養(yǎng)特征區(qū)分細(xì)菌、酵母菌、放線(xiàn)菌和霉菌。3．學(xué)會(huì)好氧微生物平板及斜面培養(yǎng)的方法。二、 實(shí)驗(yàn)原理：在自然界中，微生物的種類(lèi)很多，數(shù)量很大，為了獲得單個(gè)菌體，首先必須把要分離的材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)尼尫?，按其生長(zhǎng)所需要的條件，使其在平板上，由一個(gè)菌體繁殖成單個(gè)菌落，這樣，就能從中挑選出所需要的純種，由于細(xì)菌、放線(xiàn)菌和霉菌所要求的營(yíng)養(yǎng)條件不同，利用不同的培養(yǎng)基制成平板進(jìn)行分離，然后從菌落形態(tài)上的差異，可以把細(xì)菌、放線(xiàn)菌和霉菌三大類(lèi)群區(qū)分并可計(jì)算出其數(shù)量，分別接種到試管斜面上，然后，在平板上反復(fù)進(jìn)行分離培養(yǎng)，最后可獲得純種。三、實(shí)驗(yàn)材料和用具：1．材料（1）土壤樣品（2）培養(yǎng)基：①牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（%）牛肉膏0?3-0?5g蛋白胨1?0gNaCl0?5g瓊脂2?0g蒸餾水100mLpH7?2-7?4,0?1Mpa壓力，滅菌20-30分鐘。配制液體培養(yǎng)基時(shí)不加瓊脂；半固體培養(yǎng)基加0?3-0.5%瓊脂。該培養(yǎng)基為多數(shù)細(xì)菌通用培養(yǎng)基，可用于菌種的分離純化及保藏斜面。2．用具無(wú)菌培養(yǎng)皿、無(wú)菌吸管、無(wú)菌水、酒精燈、接種環(huán)、接種針、火柴等。四、實(shí)驗(yàn)方法：1．稀釋涂布平板法：（1）倒平板彳將滅菌的培養(yǎng)基加熱融化，倒平板。瓊脂是固體培養(yǎng)的支持物，它在 95C融化，40C以下凝固，將已滅菌的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基融化后（水浴融化）冷卻至掉或燙死；溫度過(guò)低，則培養(yǎng)基凝固，不易倒出）。45-50的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基融化后（水浴融化）冷卻至掉或燙死；溫度過(guò)低，則培養(yǎng)基凝固，不易倒出）。45-50C（溫度過(guò)高，培養(yǎng)皿蓋上凝結(jié)水太多，菌易被沖倒平板方法：右手的虎口、姆指和食指握住三角瓶，左手翻轉(zhuǎn)手掌，以無(wú)名指與小指在火焰處拔出棉塞（或塑料試管帽、硅膠泡沫塞），微燒瓶口一周，左手把皿蓋打一縫，容三角瓶口探入（見(jiàn)圖 1）傾入培養(yǎng)基后，迅速將皿蓋蓋妥，平放桌上，輕輕旋轉(zhuǎn)，使培養(yǎng)基與土壤稀釋液充分混勻，待凝固后，即成平板。（2）稀釋土樣：稱(chēng)1°克土樣，在火焰旁加到有90mL無(wú)菌水和少許玻璃珠的三角燒瓶?jī)?nèi)，將瓶子依左右方向振蕩數(shù)十次（或-1在振蕩器上振蕩分散），使土樣與水充分混合，將菌分散，土樣中的菌被稀釋了10倍，土壤懸液的稀釋度為10。在火焰處打開(kāi)無(wú)菌吸管的紙?zhí)祝ɑ蛴梦⒘考訕悠餮b上無(wú)菌的塑料吸嘴），用無(wú)菌吸管吸取土壤懸液 1mL，加到一個(gè)盛有9mL無(wú)菌水的試管內(nèi)，稀釋100倍制成稀釋度為10-2的土壤懸液，將此吸管在試管內(nèi)反復(fù)吹洗3次，然后取出，通過(guò)火焰，再插入紙?zhí)變?nèi)，以備再用。輕輕搖動(dòng)試管，使菌液均勻。再用剛才用過(guò)的吸管，插入試管內(nèi)，反-3復(fù)吹洗3次，然后取出1mL菌液，加到另一支9mL無(wú)菌水中，制成稀釋度為10的土壤懸液（圖2）。用微量加樣圖1將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿內(nèi)-4 -5 -6器亦需反復(fù)吸吹3次，用畢棄去塑料吸嘴。同法按每級(jí)稀釋 10倍的次序得到10、10、10的土壤稀釋液。

圖2稀釋過(guò)程示意圖圖2稀釋過(guò)程示意圖涂布及培養(yǎng)-6將上述稀釋好的土壤菌液，用最后一支吸管(或塑料吸嘴)，由最小的稀釋液( 10)開(kāi)始吸取0?1mL加到-6-5-4編號(hào)為10的培養(yǎng)皿中央，再依次分別從 10、10試管中各吸取0?1mL稀釋液，加到相應(yīng)編號(hào)的培養(yǎng)皿中央，每次吸取時(shí)，吸管都要在稀釋液中反復(fù)吹洗幾次。 用無(wú)菌玻璃棒按照?qǐng)D3所示，在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布均勻，靜止5-10min，使菌液吸附進(jìn)培養(yǎng)基。將培養(yǎng)皿倒置于 37C的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1-3天，每24h觀(guān)察一下菌落的生長(zhǎng)狀態(tài)，并記錄細(xì)菌、霉菌菌落的數(shù)目并描述所見(jiàn)菌落的形態(tài)。圖3圖3平板涂布操作圖挑菌落將培養(yǎng)出的單個(gè)菌落分別挑取少許細(xì)胞接種到斜面培養(yǎng)基上。置于 37C的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待菌苔長(zhǎng)出后，檢查其特征是否一致，同時(shí)將細(xì)胞涂片染色后用顯微鏡檢查是否是單一微生物。若發(fā)現(xiàn)有雜菌，需要再一次進(jìn)行分離、純化，直到獲得純培養(yǎng)。斜面接種技術(shù)：操作時(shí)按圖4的順序，并注意教師的示范操作。試管先貼上標(biāo)簽，注明菌名、日期和姓名，然后將菌種斜面和欲接種斜面試管架在左手虎口之上，用食指和中指夾住試管,大姆指按在二管中央，菌種管口在外方，斜面稍朝上。

先將棉塞（或塑料帽、硅膠泡沫塞）用右手扭轉(zhuǎn)松動(dòng)，以利接種時(shí)拔出。右手拿接種環(huán)末端，使其垂直于火焰中，燒紅滅菌。用右手小指、無(wú)名指和手掌拔掉棉塞。以火焰灼燒管口，燒時(shí)應(yīng)不斷轉(zhuǎn)動(dòng)試管口，使試管口沾染的少量雜菌得以燒死。將燒過(guò)的接種環(huán)伸入菌種管內(nèi)，先將環(huán)接觸沒(méi)有長(zhǎng)菌的培養(yǎng)基部分，使其冷卻，以免燙死被接種的菌體,然后輕輕接觸菌體，取出少許，慢慢將接種環(huán)抽出試管。迅速將接種環(huán)在火旁伸進(jìn)欲接種試管，在培養(yǎng)基上輕輕劃蛇形線(xiàn)，劃線(xiàn)時(shí)要由底部到頂部，由下而上，但不要把培養(yǎng)基劃破，也不要使菌種污染管壁。火焰灼燒試管口，并在火旁將塞塞上，塞棉塞時(shí)，不要用試管去迎棉塞，以免試管在運(yùn)動(dòng)時(shí)污染雜菌。放回接種環(huán)前，將環(huán)在火焰上再燒紅滅菌，放下接種環(huán)后，再騰出手將棉塞塞緊。irl(21irl(21圖4斜面接種技術(shù)2平板劃線(xiàn)分離法為了保證菌落為單克隆，在稀釋涂布平板培養(yǎng)分離的基礎(chǔ)上進(jìn)行平板劃線(xiàn)再分離操作。（1）倒平板：按照稀釋涂布平板法倒平板，并用記號(hào)筆標(biāo)明培養(yǎng)基名稱(chēng)、菌落編號(hào)和實(shí)驗(yàn)日期。（2）劃線(xiàn)：左手持皿底，平板面向上，稍斜，靠近火焰，用接種環(huán)取稀釋涂布平板培養(yǎng)的細(xì)菌菌落一環(huán)在平板上劃線(xiàn)，劃線(xiàn)分離后，置于 37C溫箱中，培養(yǎng)1~2天，即出現(xiàn)單個(gè)菌落。劃線(xiàn)方法一：用接種環(huán)以無(wú)菌操作取細(xì)菌懸液一環(huán)，在平板培養(yǎng)基的一邊，做第一次平行劃線(xiàn)2~3條。轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約70°角，用燒過(guò)冷卻的接種環(huán)，通過(guò)第一次劃線(xiàn)部分，做第二次平行劃線(xiàn)。用同法通過(guò)第二次平行劃線(xiàn)，做第三次平行劃線(xiàn)。

圖5圖5劃線(xiàn)分離方式1、2、3表示劃線(xiàn)次序劃線(xiàn)方法二：先以沾有細(xì)菌懸液的接種環(huán)在平板的一端涂抹一下，使該處沾上一些細(xì)菌，然后，燒掉環(huán)上剩下的細(xì)菌，再用燒過(guò)冷卻的接種環(huán)，通過(guò)剛才涂抹的部分，左右劃線(xiàn)，不能互相接觸(圖 5)。劃線(xiàn)時(shí)，注意接種環(huán)與平板表面約成20~30。角，劃線(xiàn)分離對(duì)細(xì)菌、酵母菌較為適宜，而霉菌和放線(xiàn)菌的分離多采用稀釋分離法。3?根據(jù)菌落及培養(yǎng)特征鑒別微生物的類(lèi)型由于微生物個(gè)體表面結(jié)構(gòu)、分裂方式、運(yùn)動(dòng)能力、生理特性以及產(chǎn)生色素的能力等各不相同。因而個(gè)體在固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的情況，往往各有特點(diǎn)，按照微生物在固體培養(yǎng)基上形成菌落的特征，可用來(lái)初步辨別是何種類(lèi)型的微生物，應(yīng)注意菌落特征的形狀、構(gòu)造、大小、顏色、透明度、氣味及粘滯性等。一般來(lái)說(shuō)，(1)細(xì)菌和酵母的菌落是比較濕潤(rùn)的，用接種環(huán)極易將菌體挑起。放線(xiàn)菌的菌落硬度較大，干燥致密，且與培養(yǎng)基緊密結(jié)合，不易被針挑起。霉菌菌落呈蛛網(wǎng)狀、絨狀或棉絮狀。如果要鑒定菌種，則對(duì)于微生物在液體培養(yǎng)基中以及在斜面培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的特征都應(yīng)比較詳細(xì)地觀(guān)察，通常用接種針挑取菌體少許，在斜面上由下到上部劃成直線(xiàn)接種，培養(yǎng)后，觀(guān)察生長(zhǎng)旺盛的程度，形狀，顏色及光澤等(圖6)。AVQ-8如*林熔林特征圖6平板上細(xì)菌菌落和斜面劃線(xiàn)生長(zhǎng)的形狀五、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：1.按教師指定的小組進(jìn)行從土樣中用釋釋分離法分離細(xì)菌，待單菌落長(zhǎng)出后，移接斜面培養(yǎng)，并計(jì)算出每克土中樣微生物的數(shù)量。2.從稀釋涂布平板上挑去疑似單菌落用平板劃線(xiàn)法進(jìn)一步分離出細(xì)菌的單菌落，純化，并移接斜面培養(yǎng)。六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告：1?選擇剛好能把菌分開(kāi)，而稀釋倍數(shù)最低的平板（一般含菌落 20-300個(gè)），計(jì)算每克土中樣微生物的數(shù)量：平均菌薄數(shù)兀韓降倍數(shù)微牛羽的蒯羽劇『個(gè)陽(yáng)罰= 亠土