高效親和色譜分離純化生物大棚蛋白和人血白蛋白

高效親和色譜分離純化生物大棚蛋白和人血白蛋白

許多方法可以分離和提取生物較大的分子，其中大多數(shù)是根據(jù)不同的物理和化學(xué)性質(zhì)，如分子大小、溶解和顆粒性質(zhì)。但這些方法煩瑣,回收率較低。開(kāi)發(fā)新的分離純化工藝是提高分離純化效率、降低生產(chǎn)成本的重要途徑。親和層析利用了生命現(xiàn)象中生物分子間特異的相互作用而進(jìn)行分離純化的方法。但常有如下問(wèn)題:(1)層析柱易于阻塞和污染,使用壽命短;(2)受基質(zhì)限制,柱效降低;(3)在層析過(guò)程中,底物被吸附和洗脫的過(guò)程緩慢,分離周期延長(zhǎng);(4)某些配基與底物可存在多點(diǎn)的相互作用,這可能會(huì)造成峰分裂和不可逆吸附現(xiàn)象;(5)由于柱容量的限制,這一技術(shù)還不能廣泛應(yīng)用于較大規(guī)模的制備中。新型的親和技術(shù)———高效親和液相色譜、親和膜過(guò)濾、親和萃取、親和電泳、親和逆流分溶、批量吸附和分子印記卻使得生物分子間這種專一而又可逆的特異性作用在多方面得到發(fā)展及應(yīng)用。1基于生物活性的高效親和色譜檢測(cè)高效親和液相色譜(HPAC)是將經(jīng)典親和色譜的高特異性同高效液相色譜的快速、高效相結(jié)合產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)的分離技術(shù)。它使經(jīng)典親和色譜原來(lái)需要幾個(gè)小時(shí)才能完成的純化工作縮短為十幾分鐘或更短,而且純化倍數(shù)高,分離效果好。ChenJianzhong等用HSA柱研究藥物(殺鼠靈、它莫西芬、苯妥英)和beta-CD之間的相互關(guān)系時(shí)把少量藥物注射到HSA柱中,而流動(dòng)相中是不同濃度的betaCD。把beta-CD的濃度作為藥物的滯留因素,測(cè)出它的變化值來(lái)決定注射藥物和beta-CD之間的穩(wěn)定常數(shù)。KarlssonG等用肝磷脂親和高效液相色譜從AT中分離LAT、P-LAT和nativeLAT。LAT和P-LAT都是從AT的部分變異,LAT有抗癌的作用,P-LAT和nativeLAT具有抑制凝血酶的作用。目前,高效親和色譜所使用的基質(zhì)主要為大孔硅膠,它們具有很好的機(jī)械強(qiáng)度,但化學(xué)穩(wěn)定性差,尤其不適于在偏堿性的條件下使用,而且硅膠表面殘余硅羥基對(duì)蛋白質(zhì)有較強(qiáng)的非特異性吸附,使蛋白質(zhì)的回收率降低。如趙瑩歆等以粒徑單分散聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球?yàn)檩d體,以肝素為配基制成高效親和層析填料。該填料具有很好的機(jī)械強(qiáng)度和親水性,可在高壓及高流速的條件下使用,且操作壓力低。該填料對(duì)蛋白質(zhì)的非特異性吸附能力低,可直接從血漿中分離出AT2Ⅲ和人血白蛋白,回收率分別達(dá)到96.9%和94.4%。2組成、特點(diǎn)膜分離[10—12]是20世紀(jì)60年代以來(lái)發(fā)展較快的一項(xiàng)分離技術(shù),它具有操作條件溫和、無(wú)污染、無(wú)相變等特點(diǎn)。親和膜過(guò)濾技術(shù)不僅利用了生物分子的識(shí)別性能,分離低濃度的生物制品;而且膜的滲透性及通量大,能在純化的同時(shí)實(shí)現(xiàn)濃縮,此外還有操作方便、設(shè)備簡(jiǎn)單、便于大規(guī)模生產(chǎn)的特點(diǎn)。這一技術(shù)方法包括兩個(gè)分支:親和錯(cuò)流過(guò)濾和親和膜分離技術(shù)。2.1acff分離聚合物親和錯(cuò)流過(guò)濾(ACFF)技術(shù)由Medda于1981年首次提出,是將水溶性或非水溶性高分子親和載體產(chǎn)物進(jìn)行特異性反應(yīng),然后用膜進(jìn)行錯(cuò)流過(guò)濾。ACFF的關(guān)鍵是大分子親和配基及基質(zhì)?；|(zhì)常是聚合物組成的內(nèi)核,大分子的親和配基連接在內(nèi)核表面。由這一配基對(duì)所要提取的目標(biāo)物進(jìn)行專一可逆的吸附,形成復(fù)合體,然后用膜對(duì)混合液進(jìn)行錯(cuò)流過(guò)濾,復(fù)合體因分子巨大可被保留,雜質(zhì)則隨液體透過(guò)膜,從而實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)物與其它成分的分離?；|(zhì)有水溶性和非水溶性兩種。常用的兩種水溶性基質(zhì)為葡聚糖和聚丙烯酰胺。非水性基質(zhì)較多,如酵母細(xì)胞、芽孢桿菌、鏈球菌、脂質(zhì)體等。ACFF技術(shù)已經(jīng)成功地應(yīng)用在許多蛋白質(zhì)、酶的分離和純化上。Romero等選用牛血清白蛋白(BSA)作為立體選擇性大分子配基分離D-和L-型色氨酸,確定了酸度值為pH(7~10)是L-型色氨酸為親和結(jié)合的最佳值。2.2接枝型親和膜amc親和膜分離技術(shù)(AMC)是將親和層析和膜分離技術(shù)有機(jī)結(jié)合起來(lái),與ACFF相比,AMC是帶有親和配基的分離膜直接進(jìn)行產(chǎn)物分離,因此,“親和膜”就成了該種純化技術(shù)的“中心”。采用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)途徑,將膜上所具有的某些官能團(tuán)改性,接上一個(gè)“間隔臂”分子。在一定的條件下,合適的親和配基同間隔臂分子以共價(jià)方式結(jié)合,生成帶有親和配基的親和膜。當(dāng)樣品混合液緩慢地通過(guò)膜時(shí),樣品中欲分離的生物分子與配基之間產(chǎn)生強(qiáng)烈的生物特異性作用,生成配基-配體復(fù)合物,其它分子則隨流動(dòng)相沖洗出去;然后改變流動(dòng)相的組成,使被吸附的生物分子從配基上選擇性解吸出來(lái)而實(shí)現(xiàn)分離。AMC技術(shù)對(duì)膜的要求很高,必須有足夠大的孔徑和表面積,在膜表面有足夠數(shù)量的可利用化學(xué)基團(tuán),以便接著間隔臂和配基。常用的親和膜載體材料有:纖維素、殼聚糖、聚偏氟乙烯、尼龍等。Ghayeni研制了反滲透膜,此膜對(duì)細(xì)胞有一定的吸附作用。具有分子識(shí)別功能的膜可用于區(qū)分手性分子、藥物檢測(cè)等。Julbe等提出“化學(xué)閥膜”(thechemicalvalvemembrane)的概念。魏桂林等以纖維素膜為親和基質(zhì),接枝后分別以聚賴氨酸和季銨鹽為配基,制備了兩種親和膜介質(zhì),用于去除磷酸緩沖液(pH7.4)及人血白蛋白溶液中的膽紅素。對(duì)磷酸緩沖液中膽紅素的去除率能達(dá)到70%以上,對(duì)于血白蛋白溶液中的膽紅素也能獲得高于50%的去除率。Wei等用兩個(gè)多孔親和膜包(肝素和明膠)從1mL血漿中得到0.18mg纖維連接蛋白。3親和雙水相萃取1956年Albertsson第一次用雙水相萃取(ATPE提取了生物物質(zhì)。雙水相體系的形成是兩種天然或合成的親水性聚合物水溶液相互混合,由于較強(qiáng)的斥力或空間位阻,相互之間無(wú)法滲透,在一定條件下,即可形成雙水相體系。親水性聚合物水溶液和一些無(wú)機(jī)鹽溶液相混時(shí),因鹽析作用,也形成雙水相體系。除聚合物、無(wú)機(jī)鹽外,能形成雙水相體系的物質(zhì)還有高分子電解質(zhì)、低分子化合物。親和雙水相萃取技術(shù)是在組成相系統(tǒng)的聚合物上偶聯(lián)一定的親和配基。根據(jù)配基性質(zhì)不同,常用于親和雙水相系統(tǒng)的配基有3種:基團(tuán)親和配基型、染料親和配基型和生物親和配基型。對(duì)于抗體、凝集素等雙水相萃取親和配基不能在高鹽濃度下操作;不能用于成本較低的PEG/無(wú)機(jī)鹽系統(tǒng)的缺點(diǎn),提出了以金屬螯合物為親和配基的金屬配基親和雙水相系統(tǒng)。金屬親和雙水相萃取[26—28]利用金屬離子和蛋白質(zhì)表面的精氨酸、組氨酸、半胱氨酸的親和作用,達(dá)到分離和純化蛋白質(zhì)目的。Arnold[29等用含有Cu2+-IDA-PEG的雙水相系統(tǒng)萃取了血紅素,用含有Fe3+-IDA-PEG的雙水相系統(tǒng)萃取了含磷蛋白質(zhì)。DaSilvaME等在含有PEG4000-IDA-Cu2+和PEG4000/Na2SO4雙水相系統(tǒng)中很好地純化大豆過(guò)氧化酶。XuY等采用了含有PEG-PES和PES-磷酸鹽雙水相系統(tǒng)萃取了葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)和己糖激酶。4aep的復(fù)配與生物分子的選擇性親和電泳(AEP)是將親和層析與電泳技術(shù)結(jié)合起來(lái)。在電泳時(shí),對(duì)配基具有親和作用的化合物遷移率下降或保留在原點(diǎn),AEP已經(jīng)成為分析生物分子間特異作用的常用生化技術(shù)之一,被廣泛應(yīng)用于生物樣品的純化與鑒定。AEP包括外源凝集素親和電泳和毛細(xì)管親和電泳等。4.1親和電泳技術(shù)外源凝集素親和電泳(LAE)是利用外源凝集素對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的特異性作用進(jìn)行親和電泳。原理簡(jiǎn)單,操作方便。適用于分析血清糖蛋白和酶的微異質(zhì)性。MikaelN等用外源凝集素半刀豆球蛋白(ConA)作為配體成功地把人類的AGP分離出兩個(gè)峰。4.2cae的應(yīng)用毛細(xì)管親和電泳(CAE)[32—34]是將親和技術(shù)應(yīng)用于毛細(xì)管電泳,底物-配基復(fù)合物的離解常數(shù)Kd或結(jié)合常數(shù)Kb是表征底物與配基之間特異性作用的最主要的參數(shù)。CAE可根據(jù)底物、配基與底物-配基復(fù)合物的遷移時(shí)間不同,采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳測(cè)定Kd或Kb。目前,CAE的應(yīng)用主要集中在:(1)研究底物與配基間的特異性作用,得到熱力學(xué)與動(dòng)力學(xué)參數(shù);(2)利用生物分子之間的空間特異性作用,提高毛細(xì)管電泳分離的選擇性。Kazuhiko等通過(guò)聚合N-乙烯基苯基亞氨基二醋酸得到改良的亞氨基二醋酸(IDA)和Cu(II)-IDA,用改良的Cu(II)-IDA親和毛細(xì)管電泳成功分離了HSA和HrG的混合物。CAE也可用于手性藥物及DNA片段的特異性分離。Martin等采用毛細(xì)血管區(qū)帶電泳考察了小牛胸腺DNA(CTDNA)和一組受性四肽的相互作用,根據(jù)光活性的差異,CTDNA和這些四肽的結(jié)合常數(shù)從10-2L/mol到10-6L/mol不等。Daniel等將乙基溴化物固定在聚丙烯酰胺凝膠上作為親和配基,利用CAE對(duì)DNA限制片段進(jìn)行特異性分離,同毛細(xì)管電泳比較,CAE效率更高。5分離溶劑和萃取方法逆流分溶(CCC)[38—40]是根據(jù)在兩個(gè)不相溶的溶劑中的分配系數(shù)(K)來(lái)達(dá)到分離純化的效果。與兩相溶劑逆流萃取法原理一致,但加樣量一定,并不斷在一定容量的兩相溶劑中,經(jīng)多次移位萃取分配而達(dá)到混合物的分離。萃取成功的關(guān)鍵是選擇溶劑:溶劑的分配系數(shù)(K)應(yīng)在0.5~1。預(yù)先選擇對(duì)混合物分離效果較好,即分配系數(shù)差異大的兩種不相混溶的溶劑。逆流分溶法對(duì)于分離具有非常相似性質(zhì)的混合物,往往可以取得良好的效果。但操作時(shí)間長(zhǎng),萃取管易因機(jī)械振蕩而損壞,消耗溶劑亦多,應(yīng)用上常受到一定限制。通常,分配系數(shù)的改變由溶劑體系的兩個(gè)參數(shù)決定:相對(duì)疏水性和pH值或離子濃度。ACCC是把親和配體作為第三個(gè)參數(shù),更有效地改變分配系數(shù)。此技術(shù)的配體又是溶解在液相固定相中,方便便宜。已經(jīng)報(bào)道了一些有用的配體:用bis(2-ethylhexyl)phosphoricacid分離稀有元素和重金屬元素;用N-dodecanoyl-L-proline-3,5-dimethylanilide分離氨基酸衍生物。6在特殊的微生物中的應(yīng)用有些工作中也常常不使用柱色譜,而進(jìn)行批量吸附(BA)。用離心或過(guò)濾使樣品和填料分離。磁性微球(MMS)用作親和分離的載體更適用于進(jìn)行批量吸附。因?yàn)楣桃合嗟姆蛛x在磁場(chǎng)吸引下用傾倒法即可完成,尤其是分子生物學(xué)中微量核酸的分離,使用磁性微球更為方便。磁性微球應(yīng)具備以下特點(diǎn):粒徑比較小,比表面積較大,具有較大的吸附容量;物理和化學(xué)性能穩(wěn)定,有較高機(jī)械強(qiáng)度,使用壽命長(zhǎng);含有可活化的反應(yīng)基團(tuán),以用于親和配基的固定化;粒徑均一,能形成單分散體系;懸浮性好,便于反應(yīng)的有效進(jìn)行。Briscoe等利用MMS成功地在骨髓移植過(guò)程中對(duì)骨髓中的T淋巴細(xì)胞進(jìn)行了提純,使之應(yīng)用于進(jìn)一步的分類、培養(yǎng)、功能研究和流式細(xì)胞術(shù)等。Miyachi等用MMS作為被提取物HCV2RNA的磁性探針,分離后將HCV2RNA用于PCR擴(kuò)增,效果良好。7交聯(lián)劑分離和純化膜板分子分子印跡技術(shù)(MIT)是制備具有分子識(shí)別能力聚合物的技術(shù)。具體過(guò)程是:膜板分子(待分離,識(shí)別物質(zhì)的分子)同具有官能團(tuán)的功能單體相互作用,在交聯(lián)劑的作用下形成具有大孔、網(wǎng)狀的聚合物,通過(guò)溶劑洗脫或在一定條件下水解除去膜板分子。聚合物中就形成了與膜板分子空間匹配的、具有多重作用點(diǎn)的空穴。這樣的空穴便可以與待分離混合物中的膜板分子進(jìn)行特異性的親和作用。從而達(dá)到分離,純化的目的。Zucconi等將人腦cDNA片段插入