酵母雙雜交系統(tǒng)檢測(cè)蛋白質(zhì)的研究進(jìn)展

酵母雙雜交系統(tǒng)檢測(cè)蛋白質(zhì)的研究進(jìn)展

1989年，倫琴提出并建立了一種新的遺傳方法，以直接檢測(cè)母系細(xì)胞中的蛋白質(zhì)相互作用。這一技術(shù)在細(xì)胞周期與分化、細(xì)胞凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、癌基因產(chǎn)物功能、基因表達(dá)調(diào)控及蛋白自身特性等研究領(lǐng)域,受到越來(lái)越多的關(guān)注。隨著該技術(shù)的發(fā)展和研究的深入,衍生出酵母單雜交、三雜交、反向雙雜交等體系。其應(yīng)用范圍擴(kuò)展至蛋白質(zhì)與蛋內(nèi)質(zhì)、蛋白質(zhì)與DNA、RNA及與其它小分子相互作用的研究,對(duì)新作用蛋白的發(fā)現(xiàn),蛋白間相互作用網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí),甚至對(duì)整個(gè)蛋白質(zhì)組(proteome)的研究起到巨大推動(dòng)作用。1經(jīng)典的雙重均混合系統(tǒng)1.1抑制劑序列的激活酵母雙雜交系統(tǒng)的建立基于對(duì)真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程的認(rèn)識(shí)。參與這一過(guò)群的轉(zhuǎn)錄激活因子在結(jié)構(gòu)上是組件式的(modular),往往由兩個(gè)(或兩個(gè)以上)相對(duì)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成,即DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(bindingdomain,BD)和轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域(activitiondomain,AD)。兩結(jié)構(gòu)域建立空間聯(lián)系是轉(zhuǎn)錄激活的關(guān)鍵,而單獨(dú)作用無(wú)法激活轉(zhuǎn)錄過(guò)程。分別將擬研究的獵物(prey,或稱(chēng)靶蛋白)蛋白的基因與編碼AD的序列結(jié)合,誘餌(bait)蛋白的基因與編碼BD的序列結(jié)合,形成兩段融合基因。當(dāng)兩段融合基因通過(guò)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入同一酵母細(xì)胞表達(dá)時(shí),分別生成融合蛋白prey-AD與bait-BD。借助誘餌蛋白與靶蛋白在核內(nèi)的相互作用,分離的AD與BD在空間上得以接近,形成完整的有活性的轉(zhuǎn)錄因子,進(jìn)而與上游激活序列(upstreamactivatingsequence,UAS)結(jié)合,激活相應(yīng)報(bào)告基因(reportgene)獲錄。反過(guò)來(lái),報(bào)告基因的表達(dá)與否,可判斷靶蛋白與誘餌蛋白之間是否相互作用。通過(guò)簡(jiǎn)單的酵母遺傳分析,對(duì)報(bào)告基因進(jìn)行檢測(cè),即可實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白間相互作用的分析。1.2真核酵母模型(1)采用酵母作為報(bào)道株,菌株生長(zhǎng)速度快,步驟簡(jiǎn)潔,容易操作。(2)敏感度高。許多微弱或短暫的蛋白之間的相互作用,借助報(bào)告基因表達(dá)過(guò)程中多級(jí)放大效應(yīng)反映出來(lái)。(3)在真核酵母活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行,蛋白易于保持天然折疊狀態(tài),更接近體內(nèi)真實(shí)水平。(4)酵母有許多營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)記,結(jié)果易于篩選。(5)應(yīng)用范圍比較廣泛。1.3基因治療中蛋白間相互作用的檢測(cè)(1)尋找與靶蛋白相互作用的蛋白,尤其是篩選cDNA文庫(kù)。(2)特異地檢測(cè)已知蛋白間相互作用。(3)確定蛋白相互作用的部位甚至關(guān)鍵氨基酸。(4)確定蛋白之間弱相互作用。(5)確定基因治療中多肽類(lèi)藥物作用機(jī)制。(6)建立蛋白相互作用圖譜。2母乳喂養(yǎng)系統(tǒng)的不足和對(duì)策2.1蛋白質(zhì)作用系統(tǒng)融合蛋白必須轉(zhuǎn)至核內(nèi)才能活化轉(zhuǎn)錄,這是影響雙雜交系統(tǒng)進(jìn)一步推廣的主要障礙。對(duì)于胞外受體-配體作用,以及需要核外加工修飾等翻譯后介導(dǎo)的蛋白質(zhì)作用而言,該系統(tǒng)應(yīng)用受到限制。一般而言,膜蛋白也不適于此,已出現(xiàn)通過(guò)改變某些細(xì)胞膜定位序列,在載體中添加核定位信號(hào)序列的方法以及專(zhuān)門(mén)研究非核內(nèi)蛋白作用的系統(tǒng)。2.2菌株的篩選和檢測(cè)指誘餌和靶蛋白在沒(méi)有發(fā)生作用的情況下,報(bào)告基因被激活。進(jìn)行文庫(kù)篩選時(shí),這是最常見(jiàn)的干擾實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的問(wèn)題。(1)靶蛋白本身含轉(zhuǎn)錄活化成分(如可結(jié)合報(bào)告基因上游DNA),即prey-AD自身可激活報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄。(2)誘餌蛋白本身有激活作用。對(duì)以上情況,可通過(guò)嚴(yán)格對(duì)照實(shí)驗(yàn),排除假陽(yáng)性。對(duì)誘餌和靶蛋白分別作單獨(dú)活性報(bào)告,不失為一好方法。(3)prey-AD對(duì)bait-BD無(wú)特異性,與無(wú)關(guān)的DNA結(jié)合域雜交體共轉(zhuǎn)化酵母亦表現(xiàn)陽(yáng)性。在篩出陽(yáng)性克隆后,將Prey-AD與無(wú)關(guān)DNA結(jié)合域雜交體作共轉(zhuǎn)化酵母測(cè)試,以排除假陽(yáng)性。Harper采取一種快速鑒別假陽(yáng)性的方法:用選擇性培養(yǎng)基去除陽(yáng)性克隆的bait-BD質(zhì)粒,只剩prey-AD質(zhì)粒,與不同性別的含無(wú)關(guān)DNA結(jié)合域雜交體的酵母交配,以二倍體酵母是否表現(xiàn)陽(yáng)性來(lái)鑒別假陽(yáng)性。省去了回收質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母的煩瑣步驟。(4)由于未被發(fā)現(xiàn)的調(diào)控途徑激活報(bào)告基因,這種假陽(yáng)性需用其它實(shí)驗(yàn)排除。(5)假陽(yáng)性也可能是雙雜交設(shè)計(jì)的原因:cDNA庫(kù)的構(gòu)建中,如使用隨機(jī)引物,可能使蛋白中一些非暴露區(qū)域暴露,并被篩選出來(lái);一對(duì)不在同一時(shí)間、同一種組織表達(dá)的蛋白可能發(fā)生作用,而不是生理意義上的作用。(6)某些蛋白是依賴于遍在蛋白的蛋白酶水解途徑成員,它們具有普遍蛋白間相互作用能力。可判定相互作用的特異性并增大蛋白信息量,有助于去除假陽(yáng)性結(jié)果;將報(bào)告基因整和到染色體上,可使基因表達(dá)水平穩(wěn)定,消除因質(zhì)?？截悢?shù)變動(dòng)對(duì)結(jié)果的影響。另外,可用免疫共沉淀的方法鑒定結(jié)果。2.3水資源的制備2個(gè)蛋白之間本應(yīng)發(fā)生相互作用,但報(bào)告基因不表達(dá)成表達(dá)程度低檢測(cè)不到。盡管非實(shí)驗(yàn)中主要問(wèn)題亦應(yīng)重視。常見(jiàn)原因:(1)融合蛋白對(duì)細(xì)胞有毒性。這時(shí),應(yīng)選敏感性低的菌株或拷貝數(shù)低的載體,采取共轉(zhuǎn)化的方法也可以降低毒性。(2)對(duì)于蛋白間相互作用效弱,則應(yīng)選高敏感菌株或高考貝載體。2.4使用小體誘導(dǎo)蛋白如何提高轉(zhuǎn)化率是文庫(kù)篩選成敗的關(guān)鍵,尤其是低豐度cDNA文庫(kù)篩選,必須提高轉(zhuǎn)化率。(1)共轉(zhuǎn)化較依次轉(zhuǎn)化省時(shí)省力,并可減弱或消除融合表達(dá)蛋白對(duì)酵母毒性。(2)酵母兩性接合是更為有效的方法,將誘餌蛋白載體與靶蛋白載體分別轉(zhuǎn)入不同接合型單倍體酵母中再雜交,將誘餌蛋白與靶蛋白帶入同一二倍體細(xì)胞中。Fromont-Racine等人對(duì)這一技術(shù)作了進(jìn)一步改進(jìn),用于蛋白質(zhì)組研究。以10種與mRNA前體剪接有關(guān)的蛋白作起始“誘餌”,從5×105個(gè)克隆的釀酒酵母基因組文庫(kù)中先后進(jìn)行3輪15次篩選,最終從700個(gè)陽(yáng)性克隆中得到剪切因子(新發(fā)現(xiàn)5種)及其他相關(guān)因于67種。(3)構(gòu)建文庫(kù)也非常重要,已出現(xiàn)采用體內(nèi)重組技術(shù)達(dá)到目的的方法。3關(guān)于母親飼料系統(tǒng)的進(jìn)一步發(fā)展和展望3.1蛋白質(zhì)間相互作用的鑒定哺乳動(dòng)物細(xì)胞作為宿主的雙雜交體系也在不斷改進(jìn)和推廣,酵母細(xì)胞中不能完成的某些蛋白產(chǎn)物修飾過(guò)程得以彌補(bǔ),使蛋白間作用更接近體內(nèi)實(shí)際情況。中國(guó)地鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、非洲綠猴腎(COS)等細(xì)胞是較成熟的哺乳細(xì)胞宿主。除表型篩選外,測(cè)定放線菌酮乙酰轉(zhuǎn)移酶活性來(lái)鑒定蛋白間結(jié)合程度成為常規(guī)手段。因?yàn)榇讼到y(tǒng)能更好地模擬細(xì)胞內(nèi)環(huán)境,因而利于探明蛋白相互作用的機(jī)制。3.2增加結(jié)合ndv的分子序列Wang和Rddd基于酵母雙雜交系統(tǒng)提出單雜交系統(tǒng),用于研究DNA-蛋白質(zhì)間相互作用。不同之處僅在于它省略了雙雜交系統(tǒng)中bait-BD蛋白雜交體,代之以具有蛋白重要結(jié)合位點(diǎn)的DNA。可利用DNA序列捕獲具有與之特異結(jié)合的結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。該體系最適于研究參與基因轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的蛋白質(zhì)?？捎糜诖_定已知DNA-蛋白質(zhì)之間相互作用;獲取能與順式作用元件結(jié)合的反式作用因子;準(zhǔn)確定位蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及結(jié)合的核酸序列。Wei等采用酵母單雜交體系確定了特異性結(jié)合于海膽胚胎孵化酶(SpHE)基因調(diào)控區(qū)域的反式作用因子SpEst4。酵母單雜交系統(tǒng)靈敏性高,可直接獲得與DNA特異結(jié)合的蛋白質(zhì)的基因序列。與雙雜交系統(tǒng)類(lèi)似,也同樣會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性的問(wèn)題,有待進(jìn)一步完善。3.3蛋白間相互作用三雜交系統(tǒng)是SenGupta等發(fā)展起來(lái)的,與雙雜交系統(tǒng)原理相似,只是兩雜交蛋白結(jié)合需通過(guò)第3個(gè)分子介導(dǎo)。三雜交系統(tǒng)必須滿足:兩蛋白無(wú)直接作用,必須通過(guò)第3個(gè)成分才能激活轉(zhuǎn)錄;第3個(gè)分子具有結(jié)合兩蛋白的位點(diǎn)。許多細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞過(guò)程中,兩蛋白間相互作用涉及第3個(gè)分子?；诖?三雜交系統(tǒng)用于研究蛋白與RNA、與多肽及其它小分子間的作用,大大擴(kuò)展了酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用范圍。Zhang等利用三雜交系統(tǒng)首先研究了表皮生長(zhǎng)因子(EGF)受體、Grb2和鳥(niǎo)嘌呤核酸交換蛋白(SOS)3種蛋白間相互作用。Bacharach用此系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)HIV1Gag蛋白可特異性與衣殼信號(hào)的含4個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的139個(gè)核苷酸的RNA結(jié)合。酵母三雜交系統(tǒng)較雙雜交系統(tǒng)應(yīng)用更廣,但對(duì)于不易穿膜難于進(jìn)入酵母細(xì)胞的分子不適用,同樣不適合膜蛋白的研究。3.4基于蛋白間相互作用酵母雙雜交系統(tǒng)創(chuàng)立的初衷是研究蛋白間相互作用,如果這種作用很重要,那么解離這種作用必然導(dǎo)致對(duì)生物的重大影響,而研究阻斷蛋白間相互作用的因素也就很重要。如研究如何阻斷癌基因產(chǎn)物與宿主蛋白間相互作用,以及癌細(xì)胞間信息傳遞。逆向雙雜交系統(tǒng)由Shih等創(chuàng)立,可作為酵母雙雜交系統(tǒng)較好的補(bǔ)充。與酵母雙雜交系統(tǒng)比較,突出的特點(diǎn)在于構(gòu)建一種反向篩選報(bào)告基因,即蛋白間特異相互作用所激活的報(bào)告基因能阻礙轉(zhuǎn)化體(宿主菌)的生長(zhǎng),從而發(fā)現(xiàn)蛋白間結(jié)合的解離因素。Shih等用該系統(tǒng)對(duì)阻斷環(huán)腺苷酸(cAMP)效應(yīng)分于結(jié)合蛋白與輔助因子相互作用的誘變劑進(jìn)行了研究。Vidal等據(jù)此發(fā)現(xiàn)了影響轉(zhuǎn)錄因子E2F1中與DP1相互作用的點(diǎn)突變。另外,還有雙誘餌系統(tǒng),而分離的泛素系統(tǒng)、蛋白片段互補(bǔ)分析、阻遏物重構(gòu)分析及研究膜蛋白的SOS恢復(fù)系統(tǒng)等非轉(zhuǎn)錄篩選系統(tǒng),是利用蛋白質(zhì)的其它結(jié)構(gòu)特點(diǎn)來(lái)建立的全新系統(tǒng),不依賴轉(zhuǎn)錄因子活性