丙戊酸鈉孤獨癥模型大鼠海馬ca1的表達

丙戊酸鈉孤獨癥模型大鼠海馬ca1的表達

康復訓練是一種以社會交際障礙、語言障礙和異常行為為主要特征的發(fā)展障礙疾病。這是自閉癥（asd）中最常見的類型。EDuchan等收集近40年來的流行病學資料報道孤獨癥譜系障礙的患病率為2.75‰。2011年我國10省市的調查數(shù)據(jù)顯示兒童孤獨癥總患病率為2.55‰;且患病率呈逐年上升趨勢。除三大癥狀外,許多孤獨癥患者伴有中重度智力低下和行為問題,且治療困難,給患者、家庭及社會造成嚴重的負擔。本文通過建立丙戊酸鈉(valproicacid,VPA)孤獨癥動物模型,觀察VPA孤獨癥模型鼠海馬CA1區(qū)核轉錄因子κB(Nuclearfactor-kappaB,NF-κB)和小清蛋白(Parvalbumin,PV)表達水平變化,探討孤獨癥的發(fā)病機制,以期為完善孤獨癥的治療方案提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1動物飼養(yǎng)管理全部Wistar大鼠均由北京維通利華實驗動物有限公司提供。成年雌性Wistar大鼠[(220±35)g]15只與雄性Wistar大鼠[(320±25)g]30只。分別飼養(yǎng)在干凈的籠舍內,給予充分的飼料和飲水。飼養(yǎng)溫度在(20±2)℃,濕度保持在40%~60%,自然光照。所有實驗動物喂養(yǎng)程序均嚴格按照青島大學制定的實驗動物保護條例執(zhí)行。1.2方法1.2.1模型總飼養(yǎng)條件參照TSchneider等的方法建立孤獨癥動物模型。先將成年雌性(15只)與雄性Wistar大鼠(30只)分別飼養(yǎng)在干凈的籠舍內,給予充分的飼料和飲水。飼養(yǎng)溫度在(20±2)℃,濕度保持在40%~60%,自然光照條件下飼養(yǎng)數(shù)日使之適應環(huán)境。然后將1只雌性大鼠與2只雄性大鼠合籠過夜,于第2天早晨精確檢查到陰栓的雌鼠記為胚胎第1天(E1)。將孕鼠與雄鼠分籠飼養(yǎng)。在E12.5天時按照600mg/kg的VPA(VPA粉用生理鹽水配成250mg/mL溶液)給予模型組孕鼠腹腔注射;對照組孕鼠按等量的生理鹽水腹腔注射。每只孕鼠單獨籠子飼養(yǎng),于E22天時模型組母鼠共產(chǎn)下子鼠97只,其中雌性41只,雄性56只;對照組母鼠共產(chǎn)下子鼠41只,其中雌性18只,雄性23只。出生當日記為生后第1天(P1),子鼠于P21d時斷乳,區(qū)分雌雄子鼠后與母鼠分籠飼養(yǎng)。由于TSchneider等的研究發(fā)現(xiàn)孤獨癥模型組中雄鼠行為表現(xiàn)較雌鼠行為表現(xiàn)更接近孤獨癥患者的臨床表現(xiàn),故本次試驗只研究雄鼠,剔除雌鼠。1.2.3免疫組化染色動物標本取材:每組隨機選取12只雄鼠作為研究對象,在大鼠6周齡時,腹腔注射麻醉大鼠,以磷酸鹽緩沖液配制的4%多聚甲醛300mL,心臟灌注約1.5h,取出腦組織于甲醛外固定過夜。常規(guī)脫水、石蠟包埋、丘腦水平連續(xù)冠狀切片,用于海馬CA1區(qū)免疫組化染色。其余步驟按試劑盒說明書操作。采用多功能真彩色細胞圖象分析管理系統(tǒng)(美國MediaCybernetics公司ImageProPlus)對海馬CA1區(qū)的免疫反應陽性細胞進行計數(shù)。進行400×的顯微照相,每張切片測定部位隨機選取5個視野,取平均值作為其平均陽性細胞數(shù)。海馬CA1區(qū)錐體細胞觀察:取切片行常規(guī)HE染色,光鏡下(400×)觀察海馬CA1區(qū)錐體細胞形態(tài)學改變。1.3統(tǒng)計方法2結果2.1平均瞳眼時間和體重情況通過評價模型鼠與對照鼠的體重指標及睜眼時間,發(fā)現(xiàn)孤獨癥模型組雄鼠體重較對照組雄鼠低[(48.75±2.42)gvs(50.52±2.58)g,t=2.8973,P=0.0049];孤獨癥模型組雄鼠平均睜眼時間(14.94±0.84)d明顯晚于正常對照組雄鼠(12.74±0.73)d,差異有統(tǒng)計學意義(t=10.9655,P=0.0000)。根據(jù)雄鼠的睜眼時間并結合體重情況與行為學表現(xiàn),將孤獨癥模型鼠中睜眼時間和體重接近正常對照組的視為造模失敗的雄鼠從模型組中剔除8只,這樣孤獨癥模型組雄鼠48只;正常對照組雄鼠23只。孤獨癥模型組和正常對照組雄鼠中隨機選取12只作為研究對象,其學習記憶能力表現(xiàn)為與正常對照組比較,孤獨癥模型組鼠的嘗試次數(shù)增加,再現(xiàn)次數(shù)減少。見表1。2.2馬下區(qū)1個區(qū)域的nf-b和pv陽性輸出孤獨癥模型組和正常對照組雄鼠(與結果一中的雄鼠相同)海馬CA1區(qū)NF-κB、PV免疫陽性細胞數(shù)差異有統(tǒng)計學意義。見表2。3討論3.1拉普氏模型的小鼠育種和評價3.2免疫組織中nf-b的表達近年來的研究顯示中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥和細胞凋亡與孤獨癥有關。NF-κB廣泛存在于多種細胞,參與與多種病理生理活動,如免疫應激、炎癥反應、細胞凋亡和細胞黏附等,是一種具有調節(jié)炎癥和凋亡過程中細胞反應的重要轉錄因子,提示NF-κB可能和孤獨癥發(fā)生有關。本研究結果發(fā)現(xiàn)與正常對照組子鼠比較,孤獨癥模型組子鼠海馬CA1區(qū)NF-κB的表達增強,提示CA1區(qū)NF-κB的變化可能在孤獨癥的發(fā)生中發(fā)揮作用。小清蛋白(parvalbumin,PV)是一種鈣結合蛋白,是抑制性系統(tǒng)的主要神經(jīng)化學物質。王維霞等證實孤獨癥模型鼠的前額葉皮質、杏仁體及海馬中的PV陽性神經(jīng)元形態(tài)和數(shù)量均發(fā)生不同程度的變化,提示PV及PV陽性神經(jīng)元與孤獨癥的發(fā)病相關。本研究結果發(fā)現(xiàn)與正常對照組鼠比較,孤獨癥模型鼠海馬CA1區(qū)PV的表達增強。ISplawski等研究發(fā)現(xiàn)ASD患者T型鈣通道基因CACNA1H發(fā)生突變,而這種突變可能導致鈣通道活性減低,造成細胞內Ca2+減少、神經(jīng)元興奮性減弱,這些改變對大腦的發(fā)育產(chǎn)生影響。PV也是一種鈣結合蛋白,在調節(jié)神經(jīng)元膜內外鈣平衡過程起重要作用,PV表達水平的變化可能通過這一機制在孤獨癥的發(fā)病中發(fā)揮作用?？傊?本研究通過建立VPA孤獨癥動物模型來探討孤獨癥可能的發(fā)病機制,發(fā)現(xiàn)孤獨癥模型鼠海馬CA1區(qū)NF-κB和PV陽性神經(jīng)元的表達水平改變,而這種改變可能與孤獨癥的發(fā)生有關,當然還需要大量的基礎及臨床試驗進行進一步驗證。1.1.2par主動型抗bs-1339r丙戊酸鈉(VPA,Sigma)。一抗:NF-κB-p65一抗BA2311(博士德),Parvalbumin一抗BS-1299r(博奧森);二抗:SP-9001(中杉)。DAB顯色劑(中杉);磷酸鹽緩沖液(PBS)(石家莊德薩商貿);多聚賴氨酸(sigma);蘇木素染液(石家莊德薩商貿)等。1.2.2雄鼠學習能力檢測參照TSchneider等報告的造模與評價方法,分別記錄模型組和對照組雄鼠在生后12~16d睜眼情況、行為表現(xiàn)以及雄鼠P21d斷乳時的體重;P28d時采用Y型電迷宮測試模型組和對照組雄鼠的學習記憶能力。Y型電迷宮學習記憶能力測試方法如下:在較暗、安靜的環(huán)境下進行測驗,將雄鼠放入迷宮的任何一臂中,雄鼠在三條臂內自由活動,熟悉環(huán)境5min后雄鼠所在的臂為起始臂,給予電刺激(電壓50V,電流0.4~0.6mA,延遲5s),而其余兩臂中的任一臂給予燈光信號(安全區(qū))。雄鼠進入安全區(qū)即為正確反應,否則為錯誤反應。以連續(xù)9次正確反應后的次數(shù)為雄鼠學習行為能力,達到學會標準所需訓練次數(shù)(嘗試次數(shù))越少表示雄鼠學習能力越強。記憶功能測試檢驗:間隔24h依照上述方法再次測試,連續(xù)測試10次并記錄正確反應次數(shù)(再現(xiàn)次數(shù)),以再現(xiàn)次數(shù)作為雄鼠的記憶功能。應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對相關數(shù)據(jù)進行t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。HSGo等的研究證實VPA可通過活化NF-κB信號通道和上調Bcl-XL的表達來抑制神經(jīng)祖細胞的死亡,而這可能與智力缺陷和類孤獨癥行為有關。KMDalton等研究也發(fā)現(xiàn)大鼠胚胎發(fā)育的第11天到第13天是神經(jīng)管閉合的階段,在此階段接觸VPA可能影響神經(jīng)系統(tǒng)正常發(fā)育分化,使后代在發(fā)育特征和行為表現(xiàn)方面與人類孤獨癥患者臨床表現(xiàn)相近。多年的研究發(fā)現(xiàn)VPA動物模型具有良好的表現(xiàn)效度、結構效度,重復性好,是一種較為經(jīng)典的建模方式。TSchneider等在大鼠妊娠的第12.5天時通過腹腔注射VPA建立孤獨癥動物模型,觀察大鼠行為特征的改變,發(fā)現(xiàn)與孤獨癥患兒的行為極為相近。本研究參照TSchneider等的方法建立孤獨癥動物模型,模型鼠表現(xiàn)出明顯的行為學異常,體現(xiàn)在孤獨癥模型鼠的睜眼時間較正常對照鼠晚;孤獨癥模型鼠P21