肺炎鏈球菌組氨酸激酶的同源模建及與adp的相互作用

肺炎鏈球菌組氨酸激酶的同源模建及與adp的相互作用

兩個群體系統(tǒng)（tc）是大多數(shù)用于調(diào)節(jié)細菌外部環(huán)境變化、調(diào)節(jié)中毒傾向和生存所需的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)之一。在不同細菌中,該系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)非常類似,都由組氨酸激酶和反應(yīng)調(diào)節(jié)子組成。其中,組氨酸激酶是一個自身具有激酶、磷酸轉(zhuǎn)移酶和磷酸酶活性的多功能酶,是原核生物中此調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)通路中的核心蛋白。其作用機制為外界信號作用于組氨酸激酶的膜外配體結(jié)合域,組氨酸發(fā)生自身磷酸化,并將磷酸基團轉(zhuǎn)移到反應(yīng)調(diào)節(jié)子上,而產(chǎn)生一系列的調(diào)控反應(yīng)。迄今為止,在哺乳動物(包括人類)中未發(fā)現(xiàn)類似的調(diào)控系統(tǒng),這使得組氨酸激酶可能成為新型抗生素研發(fā)的潛在靶標(biāo)。組氨酸激酶YycG屬于Pho亞家族,其最初是在枯草桿菌中被鑒定的。肺炎鏈球菌中的YycF/YycG也被命名為MicAB或VicR/K,是目前肺炎鏈球菌中已發(fā)現(xiàn)的13對TCS之一。該系統(tǒng)具有高保守性和低G+C含量的特點,不僅影響肺炎鏈球菌的存活,而且還參與了細菌毒力、感受態(tài)的形成,以及維持菌體膜的完整性等。因此,以組氨酸激酶YycG作為靶點有望篩選到有效的抗菌新藥。目前,已有針對枯草桿菌及表皮葡萄球菌的組氨酸激酶YycG進行模建和虛擬篩選出一些有效的抑制劑的報道[9.10],而對肺炎鏈球菌的相關(guān)研究國內(nèi)外仍未見報道。因此本研究擬通過肺炎鏈球菌的組氨酸激酶YycG為研究對象進行同源模建,以期為發(fā)現(xiàn)特異性的激酶抑制劑提供理論指導(dǎo)。1材料和方法1.1序列來源和設(shè)備1.2方法1.2.1聯(lián)配的結(jié)果模式采用InsightII中Align123模塊聯(lián)配YycG與2c2a的序列,確定序列的一致性和相似性。計算時設(shè)置打分矩陣為Blosum62和默認(rèn)的插入罰分和空位罰分值。聯(lián)配的結(jié)果再根據(jù)2個序列的配對序列比對(Pairwisesequencealignment)、多序列比對(Multiplesequencealignment)結(jié)果及已知的保守氨基酸位置進行微調(diào),原則是:使得保守氨基酸一一對應(yīng),盡量使得空白和插入部分在序列的β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲區(qū)域。一般的兩序列聯(lián)配算法考慮到全長序列的匹配和打分,沒有考慮到序列的二級結(jié)構(gòu)信息和保守氨基酸信息,故兩序列匹配的結(jié)果需要根據(jù)序列結(jié)構(gòu)知識予以手工微調(diào)。1.2.2立體化質(zhì)量的確定根據(jù)1.2.1序列聯(lián)配結(jié)果用InsightII中的Modeler模塊構(gòu)建蛋白的結(jié)構(gòu)模型,共進行10次Modeler計算。在模建過程中采用中等優(yōu)化水平,從產(chǎn)生的10個目標(biāo)蛋白模型中選擇同率密度函數(shù)(Probabilitydensityfunction,PDF)打分和能量打分最高的結(jié)構(gòu),進一步作能量優(yōu)化和結(jié)構(gòu)修正,最后得到模建結(jié)果。接著用ProCheck驗證立體化學(xué)性質(zhì)的合理性,用Profile_3D對模建結(jié)構(gòu)中氨基酸序列的相容性進行初步評價打分。主要以ProCheck結(jié)果為主,參考模建結(jié)構(gòu)與模板結(jié)構(gòu)的RMSD大小和Profile_3D的結(jié)果,從候選模型中選取評價最高的結(jié)構(gòu)作為最終的模型,并對該結(jié)構(gòu)進行進一步能量優(yōu)化及分子動力學(xué)模擬。1.2.3其他原子優(yōu)化體系首先對模擬體系進行分子力學(xué)平衡優(yōu)化,采用Gromacs軟件,用共軛梯度法先固定重原子優(yōu)化體系500步,然后固定Cα再優(yōu)化體系500步,最后全原子優(yōu)化500步。其次進行分子動力學(xué)優(yōu)化,利用Gromacs軟件,先往體系中加水,構(gòu)建一個長方體的盒子,包含水相和蛋白質(zhì);然后采用逐步升溫最終將體系的溫度升到300K,在此溫度下蛋白質(zhì)振動20000步,每一步0.002ps,共40ps,每0.5ps收集一個構(gòu)象。最終選取達到平衡處的構(gòu)象做為后續(xù)工作的模型。1.33蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的重疊將得到的結(jié)構(gòu)模型與2c2a的Cα原子疊合點進行疊合,觀察YycG蛋白活性腔骨架及關(guān)鍵殘基位置的改變。1.4實驗2:局部識別法設(shè)計YycG結(jié)構(gòu)模型和小分子的晶體結(jié)構(gòu)分別在AutoDockTools1.4.5(ADT)中進行預(yù)處理,YycG和ADP都添加極性氫,加Gasteiger電荷,由ADT處理后存為pdbqt格式文件。然后依據(jù)與模板蛋白2c2a的活性結(jié)合位點結(jié)構(gòu)相同的位點為口袋,口袋周圍選取幾個殘基,然后以這些殘基的中心為格點盒子的中心,產(chǎn)生一個格點間距0.375?,x、y、z三個方向各為60個格點的立方體盒子。Autodock程序以autogrid4產(chǎn)生grid文件,該文件中包括探針原子在各個網(wǎng)格點與受體的相互作用能。最后Autodock運用Lamarchian遺傳算法,將局部能量搜索與遺傳算法相結(jié)合,以半經(jīng)驗函數(shù)作為能量打分函數(shù),對ADP構(gòu)象和位置進行全局搜索,對ADP與模建結(jié)構(gòu)進行獨立的10次對接實驗。再對對接結(jié)果進行成簇分析,最后依據(jù)最低對接能來選取對接結(jié)合模式進行相互作用分析。2結(jié)果2.1同源模建ro肺炎鏈球菌組氨酸激酶YycG蛋白的ATPase_c激酶功能域的序列與PDB數(shù)據(jù)庫中的蛋白序列比對發(fā)現(xiàn),其序列與PDB編號為2c2a的ThermotogamaritimaX晶體衍射結(jié)構(gòu)(分辨率1.9?,R因子0.247)具有33%的一致序列,57%相似性(圖1),表示Thermotogamaritima晶體結(jié)構(gòu)適合做肺炎鏈球菌YycG蛋白ATPase_c激酶功能域的同源模建的模板。模建得到的結(jié)構(gòu)用Procheck(圖2)和Profile-3D(圖3)進行評價。從拉氏圖(Ramachandran)中可見模建結(jié)構(gòu)蛋白的主鏈結(jié)構(gòu)合理:主鏈二面角φ、ψ落于中心區(qū)域和“可接受區(qū)域”的殘基占97.3%,絕大多數(shù)φ-ψ角均在正常范圍內(nèi),落在不允許區(qū)域內(nèi)的幾個殘基均遠離結(jié)合位點。從Profile-3D(圖3)中可見在ATPase_c激酶結(jié)合功能域處CompatibilityScore值均大于0,說明得到的模建結(jié)構(gòu)和模板相容性較好。2.2ycg結(jié)構(gòu)模型及其活性腔的結(jié)構(gòu)特征2.2.1結(jié)構(gòu)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)如圖4所示,肺炎鏈球菌YycG的模建結(jié)構(gòu)可以很好地和Thermotogamaritime的X晶體衍射結(jié)構(gòu)進行疊合,兩者主鏈原子疊合的RMSD有大約1.4?。肺炎鏈球菌組氨酸磷酸YycG模建結(jié)構(gòu)與2c2a的晶體結(jié)構(gòu)具有相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)特征,由組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移功能域(Histidinephosphotransfer,HP)和ATP催化結(jié)合功能域(CatalyticandATP-bindingdomain,CA)2個功能域組成。HP由2個α螺旋組成,二聚體形成4個螺旋束,其中的組氨酸磷酸受體在螺旋處伸向溶劑處。ATP激酶結(jié)合功能域是1個雙層的α/β三明治的結(jié)構(gòu),其由5個β折疊和4個α螺旋組成。HATPcase_c的ATP結(jié)合的活性口袋可以分為2個不同的亞口袋,兩者由一個峽谷狀通道相連。2.2.2gly181、ile182、ile190及phe238殘基的作用肺炎鏈球菌YycGHATPase_c的模建結(jié)構(gòu)的表面特征如圖5A所示,可以看到組氨酸激酶催化區(qū)模型的結(jié)構(gòu)和疏水表面特征。ADP結(jié)合口袋有內(nèi)、外兩腔:較小的內(nèi)腔口袋相對疏水,由Tyr153、Leu180、Gly181、Ile182、Ile190以及Phe238殘基組成,ADP分子的腺苷頭部很可能作用在這個部位。從圖5B上可以看出覆蓋在結(jié)合口袋上的loop是一個親水區(qū)域,所以口袋的外腔是親水部分,較大的外腔由Phe194、Arg196、Gln205、Leu210、Gly211及Leu212組成。內(nèi)、外腔的這些殘基在已知組氨酸激酶序列中都是非常保守的。其中,活性口袋中部通道兩側(cè)有幾個重要氨基酸Asn145、Asn149、Lys152,它們起到固定底物的作用(圖6)。有研究表明,這幾個可以形成氫鍵的氨基酸在肺炎鏈球菌YycG和Thermotogamaritima的2c2a中都存在,說明這些氨基酸都是非常保守的。2.3肺炎鏈球菌中adp與底物的相互作用機理分析采用分子柔性對接軟件Autodock4.0評價模建的合理性以及預(yù)測肺炎鏈球菌組氨酸激酶YycG與底物ADP對接情況。該軟件能夠自動將底物對接到受體的活性中心或結(jié)合部位,并利用遺傳算法尋找合適的結(jié)合構(gòu)象,使得配體與受體的形狀和相互作用的匹配效果達到最佳穩(wěn)定狀態(tài),形成合理的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。經(jīng)Autodock4.0分子對接后得到了10個對接構(gòu)象,并根據(jù)RMSD值對這些構(gòu)象進行聚類分析。選取能量最低的2個類的代表性構(gòu)象,然后分析這2個構(gòu)象和YycG活性腔內(nèi)重要殘基的相互作用情況。選擇與重要殘基相互作用較好的構(gòu)象為最終的對接構(gòu)象。底物ADP與肺炎鏈球菌組氨酸激酶YycG對接后由Autodock4.0計算得到的結(jié)合自由能為-10.0kcal/mol。計算公式為:公式(1)中,L(ligand)指配體,P(Protein)指受體,P-L指的是配體和受體蛋白復(fù)合物,V是指成對的原子相互作用的評價。Bound是指結(jié)合狀態(tài),unbound是指未結(jié)合狀態(tài)。結(jié)合自由能等于4個部分:配體結(jié)合前后的分子內(nèi)能變化(VboundL-L-VunboundL-L),受體蛋白結(jié)合前后的內(nèi)能變化(VboundP-P-VunboundP-P),配體和受體結(jié)合前后的分子間能量變化(VboundP-L-VunboundP-L),以及結(jié)合以后構(gòu)象熵(conformationalentropy)的減少(△Sconf)(這一項由可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)目決定)。公式(2)中Wwdw、Whbound、Welec、Wsol分別是指小分子配體與蛋白受體范德華相互作用、氫鍵相互作用、靜電相互作用和去溶劑化作用權(quán)重系數(shù),r指原子對距離。第1項中A、B是取自Amber力場的范德華排斥和吸引參數(shù)。第2項中C是指O-H和N-H在1.9時5kcal/mol的最大勢井深;D指S-H在2.5時1kcal/mol的勢井深;E(t)指出氫鍵相互作用與角度t有關(guān)。第3項中q是原子電荷。第4項中S是原子溶劑化參數(shù),V是原子體積,距離權(quán)重因子σ為3.5。肺炎鏈球菌組氨酸激酶YycG蛋白活性位點處殘基與底物ADP的相互作用如圖7所示。用ligplot程序畫出的ADP與口袋殘基相互作用的結(jié)構(gòu)圖中,肺炎鏈球菌組氨酸激酶YycG與底物ADP間主要是通過疏水鍵和氫鍵等非極性鍵相互作用,底物ADP與模建結(jié)構(gòu)活性口袋處可形成多個氫鍵,它們分別是Asp177、Asn145、Asn149、Lys152、Tyr153和Arg196。這些氫鍵,特別是磷酸基團處與YycG可形成的氫鍵網(wǎng)絡(luò),對促進和穩(wěn)定底物ADP結(jié)合到活性中心起到了重要的作用。3分子對接實驗。在本研究中以具有1.9?分辨率的Thermotogamaritime的X晶體衍射結(jié)構(gòu)為模板,采用同源模建的方法首次模建了肺炎鏈球菌組氨酸激酶YycG蛋白的三維結(jié)構(gòu),并使用ProCheck、Profile_3D驗證了其合理性。同源模建的結(jié)果以模板結(jié)構(gòu)為依據(jù),與模板有很大的結(jié)構(gòu)相似性,因此選擇同源性較好,功能相近的模板十分重要;但是由于關(guān)鍵位點氨基酸的組成不同,模建的結(jié)構(gòu)和模板之間還是有一定的功能性的差別。這對于還未解析出可靠的晶體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)功能研究和基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計都大有裨益。通過同源模建可以更多地了解肺炎鏈球菌組氨酸激酶YycG蛋白結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系,以進一步幫助研究者發(fā)現(xiàn)新的藥物先導(dǎo)化合物和改進藥物先導(dǎo)化合物的設(shè)計。在利用Sybyl6.8軟件和模板結(jié)構(gòu)信息得到模建結(jié)構(gòu)的活性口袋后,選取天然底物ADP與肺炎鏈球菌組氨酸激酶YycG蛋白的模建結(jié)構(gòu)用Autodock4.0軟件進行分子對接研究。在分子對接時,Autodock采用遺傳算法搜索低能結(jié)合構(gòu)象。軟件對接以打分為依據(jù),所以單純的選取低能構(gòu)象未必是最佳構(gòu)象。利用文獻分析得到的關(guān)鍵殘基信息對低能構(gòu)象進行挑選,首先選取對接構(gòu)象聚類后的能量最低的2個聚類的代表性構(gòu)象,然后挑選與關(guān)鍵殘基作用較好的構(gòu)象為最終結(jié)合構(gòu)象。同樣的方法也可以用來驗證模板的結(jié)構(gòu)合理性。天然底物與合理構(gòu)建的蛋白結(jié)構(gòu)之間的結(jié)合一般要優(yōu)于不合理的蛋白結(jié)構(gòu)。在沒有已知抑制劑和蛋白結(jié)合復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)之前,用天然底物進行對接也可以更為接近真實情況地反應(yīng)活性口袋處殘基間的相互作用,由于不同的組氨酸激酶活性位點的關(guān)鍵殘基的組成和構(gòu)象會有所不同,這對以后據(jù)此結(jié)構(gòu)篩選具有一定的結(jié)合特異性的化合物提供了結(jié)構(gòu)依據(jù)。在虛擬篩選后,本實驗挑選購買化合物應(yīng)該優(yōu)先