pegdexxxran雙水相體系中bsa的分配特性

pegdexxxran雙水相體系中bsa的分配特性

與傳統(tǒng)的溶劑提取相比，雙水相萃取最大的優(yōu)點(diǎn)是，在雙水相系統(tǒng)的幫助下，生物活性物質(zhì)可以提供一個(gè)溫和的環(huán)境，并在萃取過(guò)程中保持生物活性和結(jié)構(gòu)。此外，雙水相萃取還具有收率高、成本低、連續(xù)化操作等優(yōu)點(diǎn)?，F(xiàn)被廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生物化工等領(lǐng)域的產(chǎn)品分離和提取,尤其在蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物大分子的分離純化方面更是備受關(guān)注。在蛋白質(zhì)的分離純化中,常用的雙水相體系是聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(dextran)和PEG/鹽兩類(lèi)體系。由于PEG/鹽體系的選擇性不高,且易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。故本文選擇PEG/dextran雙水相體系進(jìn)行研究,以BSA為模型蛋白,考察該體系表面性質(zhì)、電荷間作用和各種作用力(如憎水鍵、氫鍵和離子鍵)等因素對(duì)BSA分配的影響。同時(shí)選擇出雙水相體系合適的高聚物分子量與濃度,并對(duì)各影響因素進(jìn)行系統(tǒng)研究,以確定最佳操作條件,得出合適的(較小的)分配系數(shù),從而達(dá)到使BSA在dextran富集的下相分配的目的。1實(shí)驗(yàn)部分1.1上海西南大南油公司致東南方提供了單一設(shè)備的“支持”聚乙二醇規(guī)格分別是1000、4000、6000、10000,分析純,均由上海浦東高南化工廠(chǎng)提供;牛血清白蛋白、葡聚糖(分子量40000)均由Pharmacia公司提供,其它試劑均為市售分析純。1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)備TGL-16G數(shù)顯高速離心機(jī),江蘇城西曉陽(yáng)電子儀器廠(chǎng)提供;UV762紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì),上海精密科學(xué)儀器有限公司提供。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1peg溶液的配制根據(jù)Albertsson的方法繪制相圖:將已知濃度的dextran溶液逐滴加入PEG的濃溶液中,直到出現(xiàn)渾濁。記下此時(shí)的體系組成并向PEG溶液中加入1g水,搖勻待溶液變清后重復(fù)上述操作。將所記錄的體系組成以PEG濃度為縱坐標(biāo),dextran濃度為橫坐標(biāo)作圖即得到雙結(jié)點(diǎn)曲線(xiàn)(圖1)。1.3.2中性鹽的制備移取一定量的PEG原液、dextran原液以及BSA原液。當(dāng)需考察鹽和緩沖液的影響時(shí),可加若干固體中性鹽和磷酸鹽緩沖液,最后用去離子水補(bǔ)足至2g,上下倒置多次使其混勻后,室溫下靜置5min,再用3000r·min-1離心10min至兩相分離,在25℃水浴中放置12h。1.3.3分配系數(shù)的測(cè)量上、下相分別取樣,用考馬斯亮藍(lán)G250染色法測(cè)定BSA濃度,分配系數(shù)為上下相BSA濃度之比。2結(jié)果與討論2.1bsa在雙水相體系中的分配在PEG4000/dextran雙水相體系中,選擇了4種濃度,即對(duì)應(yīng)4條長(zhǎng)度不等的結(jié)線(xiàn)(保持PEG4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)9%不變,改變dextran濃度),進(jìn)行BSA分配試驗(yàn),如圖2所示(圖中線(xiàn)段AB為PEG4000/dextran雙水相體系的一條結(jié)線(xiàn)的示意圖,A、B兩點(diǎn)坐標(biāo)分別對(duì)應(yīng)于雙水相體系上下相組成)BSA在各濃度體系中的分配系數(shù)見(jiàn)圖3。由兩圖可知,隨著dextran質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,結(jié)線(xiàn)長(zhǎng)度增加,同時(shí)分配系數(shù)降低,且均小于1;BSA在具有較長(zhǎng)結(jié)線(xiàn)的雙水相體系中分配系數(shù)較低。原因是BSA的表面性質(zhì)決定了它易于在dextran富集的下相分配,且界面張力隨結(jié)線(xiàn)長(zhǎng)度呈指數(shù)規(guī)律的增加,導(dǎo)致體系中所有粒子的遷移中,上相中的BSA受界面吸附的影響不斷向下相分配占優(yōu)勢(shì)。2.2peg4000/dexran雙水相體系的優(yōu)化由4種分子量的PEG形成的雙結(jié)點(diǎn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1:在曲線(xiàn)右上方,雙水相體系分相;在曲線(xiàn)左下方,體系不分相;雙結(jié)點(diǎn)曲線(xiàn)隨著PEG分子量的增加更加靠近原點(diǎn)。這是由于兩相間的差異逐漸增大,分相所需的PEG和dextran的濃度也隨之降低。在PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)9%-dextran質(zhì)量分?jǐn)?shù)9%的濃度組成下,BSA在由PEG1000、PEG4000、PEG6000、PEG10000所形成的4種雙水相體系中的分配系數(shù)見(jiàn)圖4。隨著PEG平均分子量的增大,分配系數(shù)減小,這是因?yàn)镻EG的端基數(shù)目減少,疏水性增加,從而使親水性蛋白BSA向下相富集。對(duì)于PEG1000在此組成濃度下沒(méi)有分相,這同樣可從圖1中理解(該點(diǎn)在雙曲線(xiàn)以下的單相區(qū)內(nèi)),本質(zhì)原因是PEG1000與dextran間的相互排斥作用較其混合過(guò)程的熵增加弱。為降低系統(tǒng)黏度和節(jié)約原料,優(yōu)先選擇結(jié)線(xiàn)長(zhǎng)度較短的PEG4000/dextran雙水相體系進(jìn)行研究。由圖5可知,中性鹽的種類(lèi)不同,分配系數(shù)各不相同。原因是這些電解質(zhì)的陰陽(yáng)離子在兩相間有不同分配,由于受電中性的約束,產(chǎn)生不同的相間電位。結(jié)果表明,帶負(fù)電荷的BSA,添加NH4+較添加Na+可得到較低的分配系數(shù)。對(duì)于陰離子按下列順序降低其分配系數(shù):Ac-<SO42-<citrate3-<Cl-。由實(shí)驗(yàn)知,添加NaCl可得較小分配系數(shù),故選用NaCl進(jìn)行以下分析。2.3nacl濃度對(duì)分配系數(shù)的影響在質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG40009%-dextran400009%的雙水相體系中,考察NaCl濃度對(duì)BSA分配特性的影響,結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知,隨著NaCl濃度的升高,分配系數(shù)呈先減小后增大的趨勢(shì),且在0.2mol·L-1處達(dá)最小。這是因?yàn)楫?dāng)NaCl濃度低于0.1mol·L-1時(shí),分配系數(shù)主要由BSA所帶電荷數(shù)及兩相間疏水性差異所決定;當(dāng)NaCl濃度在0.1mol·L-1~0.2mol·L-1時(shí),BSA的帶電量起主要影響作用;當(dāng)NaCl濃度高于0.2mol·L-1時(shí),分配系數(shù)則主要被BSA與兩相的相對(duì)疏水性所影響。且在此濃度范圍內(nèi),隨著NaCl濃度的增大,PEG的疏水性不斷增強(qiáng),與BSA的非極性疏水區(qū)發(fā)生越來(lái)越強(qiáng)的相互作用,導(dǎo)致分配系數(shù)不斷上升。2.4中性鹽緩沖液體系2.4.1中性鹽種類(lèi)對(duì)BSA分配特性的影響采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG40009%-dextran9%的雙水相體系,中性鹽濃度均為0.1mol·L-1,用磷酸鹽緩沖液調(diào)控系統(tǒng)pH達(dá)7.0,結(jié)果見(jiàn)圖5。2.5聚陽(yáng)離子向等電點(diǎn)的分配系數(shù)pH的變化改變了兩相間的電位差和BSA的帶電狀態(tài),從而改變BSA的分配。由圖7知,分配系數(shù)隨pH值而變化。任一NaCl濃度下(0.1mol·L-1除外),在pH=5.0處(等電點(diǎn)pI附近)均出現(xiàn)一波峰,可以解釋為:當(dāng)pH由4.2向等電點(diǎn)逼近時(shí),BSA所帶的正電荷減小,驅(qū)使聚陽(yáng)離子向下相富集的電位差的影響作用減小,故分配系數(shù)增大;直到pH=pI時(shí),BSA所帶凈電荷為零,此時(shí)分配系數(shù)達(dá)最大;當(dāng)pH遠(yuǎn)離等電點(diǎn)繼續(xù)增大時(shí),驅(qū)使BSA聚陰離子向上相富集的電位差將不再起主要作用,這可能與BSA同兩相的相對(duì)疏水性有關(guān)。對(duì)于NaCl濃度為0.1mol·L-1的曲線(xiàn),等電點(diǎn)附近未出現(xiàn)明顯變化趨勢(shì)。這可能是pH<6時(shí),BSA同兩相的相對(duì)疏水性起主要影響作用,故導(dǎo)致分配系數(shù)的減小。當(dāng)pH>7并繼續(xù)增大時(shí),開(kāi)始受電位差的影響。由于BSA所帶的負(fù)電荷不斷增大,在電位差的影響下,聚陰離子不斷向上相富集使得分配系數(shù)呈上升趨勢(shì)。3peg/dexran體系的計(jì)算影響雙水相體系中物質(zhì)分配平衡的因素很多。作者以BSA為模型蛋白,選擇了主要的、影響較大的幾個(gè)參數(shù)對(duì)其在P