菠蘿品種SSR標(biāo)記鑒定技術(shù)規(guī)程

菠蘿品種SSR標(biāo)記鑒定技術(shù)規(guī)程范圍本標(biāo)準(zhǔn)擬規(guī)定利用簡單重復(fù)序列（SimpleSequenceRepeats，SSR）分子標(biāo)記進(jìn)行菠蘿（Ananascomosus）品種鑒定的試驗(yàn)方法、數(shù)據(jù)記錄與統(tǒng)計(jì)、判定標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容包括樣品的采集與制備、基因組DNA提取與純化、DNA質(zhì)量與濃度檢測、核心SSR引物篩選、SSR-PCR反應(yīng)與產(chǎn)物檢測、等位變異數(shù)據(jù)記錄與統(tǒng)計(jì)分析等。本標(biāo)準(zhǔn)適用于菠蘿品種資源的DNA分子數(shù)據(jù)采集和品種鑒定。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T3543.2農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T19557.1植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南總則NY/T2594-2014植物品種鑒定DNA指紋方法總則術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。核心引物CorePrimers核心引物指多態(tài)性、穩(wěn)定性、重復(fù)性等綜合特性好、作為DNA指紋鑒定優(yōu)先選用的一套引物。核心引物作為統(tǒng)一用于DNA指紋數(shù)據(jù)庫構(gòu)建和品種鑒定的引物，可保證不同實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)具有可比性。參照品種Referencevariety參照品種指對應(yīng)于SSR位點(diǎn)不同等位基因的一組品種。參照品種用于確定待測樣品在某個SSR位點(diǎn)上等位基因擴(kuò)增片段的大小，校正不同儀器設(shè)備和不同實(shí)驗(yàn)室間檢測數(shù)據(jù)的系統(tǒng)誤差。原理簡單重復(fù)序列（SSR）分布于菠蘿整個基因組的不同位置上，不同品種每個位點(diǎn)上重復(fù)單位的數(shù)目及序列可能不同，因而形成片段長度多態(tài)性。由于每個簡單重復(fù)序列兩端的序列是高度保守和單拷貝的，因而可根據(jù)其兩端的序列設(shè)計(jì)一對特異引物，經(jīng)硝酸銀染色或者熒光染料標(biāo)記加以區(qū)分。根據(jù)PCR產(chǎn)物的帶型差異鑒定菠蘿品種。儀器設(shè)備及試劑儀器設(shè)備及試劑名單見附錄A。試劑和溶液配制相關(guān)溶液配制方法見附錄B。引物本標(biāo)準(zhǔn)已利用菠蘿基因組和轉(zhuǎn)錄組開發(fā)出菠蘿SSR標(biāo)記引物300對，并通過SSR引物篩選，獲得具有高度多態(tài)性的核心引物13對（名單見附錄C）。操作程序參照品種與樣品準(zhǔn)備參照品種信息見附錄D。對于種子樣品的分樣和保存，按照GB/T3543.2的規(guī)定進(jìn)行。樣品準(zhǔn)備每份樣品至少隨機(jī)檢測5個個體（種子、幼嫩葉片等組織或器官），每個個體單獨(dú)分析。對一致性差的樣品應(yīng)增加檢測個體至10個以上，每個個體單獨(dú)分析。DNA提取采用改良CTAB法提取基因組DNA：（1）取400mg植株嫩葉，加入適量PVP于液氮中充分研磨成細(xì)粉末，置于2.0mL離心管中。（2）加入1mL預(yù)冷的CTAB-free緩沖液，振蕩混勻后冰浴10～30min。室溫，5000rpm離心10min，棄上清，重復(fù)1～2次。（3）加入1mL65℃預(yù)熱的2～3×CTAB提取液，充分輕混勻，65℃水浴30～40min，其間顛倒數(shù)次。（4）室溫，12000rpm離心10min，取上清，加入1/10體積（100μL）65℃預(yù)熱的CTAB/NaCl溶液，混勻后加入等體積（900μL）氯仿/異戊醇（24：1）抽提。（5）室溫，12000rpm離心10min，取上清，加入等體積（850μL）的Tris飽和酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）充分輕混勻。（6）室溫，12000rpm離心10min，取上清，加入等體積（800μL）的氯仿/異戊醇（24:1），充分輕混勻。（7）室溫，12000rpm離心10min，取上清，加入1/2體積（350μL）NaCl（5M）及等體積（700μL）預(yù)冷的異丙醇（?20℃），?20℃靜置30min。（8）室溫，12000rpm離心10min，棄上清，沉淀分別用1mL預(yù)冷的無水乙醇和75%乙醇（?20℃）漂洗1～2次。（9）加入500μL去離子水溶解沉淀，并加入2～5μlRNase溶液（10mg/mL），搖勻，37℃溫育30～40min。（10）加入等體積（500μL）的氯仿/異戊醇（24:1）充分輕混勻，12000rpm離心10min，取上清，加入1/10體積（50μL）3MNaAc（pH5.2）和等體積（500μL）異丙醇，充分輕混勻，?20℃靜置30min。（11）室溫，12000rpm離心10min，沉淀分別用1mL預(yù)冷的無水乙醇和75%乙醇（?20℃）漂洗1～2次。（12）室溫，12000rpm離心10min，去上清，超凈臺上晾干DNA沉淀，然后溶于150μlddH2O，4℃冰箱保存或?20℃長期保存?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)樣品的使用在進(jìn)行PCR擴(kuò)增和等位基因檢測時，應(yīng)同時包括相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)樣品。不同位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)樣品的名稱見附錄C。某一位點(diǎn)上具有相同的等位基因的標(biāo)準(zhǔn)可能不止一個，在確認(rèn)這些樣品在某一位點(diǎn)上的等位基因大小后，也可將這些樣品代替附錄C中的標(biāo)準(zhǔn)樣品。對于附錄C中未包括的等位基因，應(yīng)按本標(biāo)準(zhǔn)的方法，通過使用DNA分析儀與標(biāo)準(zhǔn)樣品同時進(jìn)行檢測確定其大小。同一名稱不同來源的標(biāo)準(zhǔn)樣品在某一位點(diǎn)上的等位基因可能不相同，在使用前應(yīng)與原標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行核對。注：多個品種在某一位點(diǎn)上可能具有相同的等位基因。在確認(rèn)這些品種某一位點(diǎn)上等位基因大小后，這些品種也可以代替附錄C中的標(biāo)準(zhǔn)樣品使用。反應(yīng)體系利用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，針對影響PCR反應(yīng)體系的5個主要因素進(jìn)行反應(yīng)體系優(yōu)化及其驗(yàn)證，最終獲得菠蘿最優(yōu)SSR-PCR反應(yīng)體系：包括基因組DNA20.0ng，1×Buffer緩沖液（含Mg2+），dNTPs2.5mmol/L，正、反向引物各30ng，Taq酶0.5U，其余以超純水補(bǔ)足。推薦使用15μL~20μL反應(yīng)體積。反應(yīng)程序94℃預(yù)變性4min，94℃變性30s，52～55℃（具體退火溫度見附錄C）退火30s，72℃延伸40s；共35個循環(huán)，72℃延伸5min，4℃保存。等位基因檢測變性聚丙烯酰胺凝膠電泳與銀染檢測清洗玻璃板將玻璃板反復(fù)擦洗干凈，雙蒸水擦洗兩遍，干燥。在長板上涂上0.5mL親和硅烷工作液，帶凹槽的短板上涂0.5mL剝離硅烷工作液。操作過程中防止兩塊玻璃板相互污染。組裝電泳板待玻璃板徹底干燥后組裝電泳板，并用水平儀調(diào)平。灌膠取60mL6%的聚丙烯酰胺膠（根據(jù)不同型號的電泳槽確定膠的用量和合適的灌膠方式），300μL過硫酸銨（APS）和60μL四甲基乙二銨（TEMED）輕輕混勻，將膠緩緩的灌入。當(dāng)膠到底部后將板放置水平。將梳子插入適當(dāng)位置，并用夾子夾緊，以防點(diǎn)樣時漏樣。聚合2h以上用于電泳。過程中防止出現(xiàn)氣泡。預(yù)電泳將梳子小心拔出，用洗瓶清洗干凈，然后擦干凈玻璃板，將電泳槽裝配好后，在電泳槽中加入1×TBE。在恒功率70W條件下預(yù)電泳30min。變性在PCR產(chǎn)物中加入3μL6×加樣緩沖液，混勻后，在PCR儀上運(yùn)行變性程序：95℃變性5min，然后立即置于冰上冷卻，使DNA保持單鏈狀態(tài)。電泳預(yù)電泳結(jié)束后，將膠面的氣泡及雜質(zhì)吹打干凈，將梳子輕輕插入，其深度為剛進(jìn)膠面1mm。每一個加樣孔點(diǎn)入5μL樣品。70W恒功率電泳至上部的指示帶到達(dá)膠板的中部。電泳結(jié)束后，小心分開兩塊玻璃板，凝膠會緊貼在長板上。銀染（快速銀染法）a）固定：固定液中輕輕晃動3min，需要固定2次，第2次固定液回收待用；b）染色：染色液中染色12min；c）漂洗：蒸餾水漂洗一次30s，第2次用雙蒸水快速漂洗，30s；d）顯影：顯影液中輕輕晃動至帶紋出現(xiàn)；e）定影：用回收的固定液定影2min；f）漂洗：雙蒸水漂洗1min。毛細(xì)管電泳熒光檢測樣品準(zhǔn)備首先根據(jù)不同的熒光基團(tuán)將PCR產(chǎn)物稀釋一定的倍數(shù)。一般6-FAM熒光基團(tuán)PCR產(chǎn)物稀釋80倍，HEX、ROX、TAMRA熒光基團(tuán)PCR產(chǎn)物稀釋30倍。然后分別取等體積的上述4種稀釋后溶液混合，從混合液中吸取1.0μL加入到DNA分析儀專用深孔板孔中。板中各孔分別加入0.1μLLIZ500分子量內(nèi)標(biāo)和8.9μL去離子甲酰胺。除待測樣品外，還應(yīng)同時包括標(biāo)準(zhǔn)樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物。將樣品在PCR儀上95℃變性5min，立即取出置于碎冰上，冷卻10min以上。瞬時離心10s后上機(jī)電泳。開機(jī)準(zhǔn)備打開DNA分析儀，檢查儀器工作狀態(tài)。更換緩沖液，灌膠。將裝有樣品的微孔板置放于樣品架基座上。打開數(shù)據(jù)收集軟件。編輯電泳板點(diǎn)擊菜單中的“platemanager”按鈕，然后在右側(cè)窗口點(diǎn)擊“New”按鈕創(chuàng)建一個新的電泳板，在“Name”和“ID”欄中輸入電泳板的名稱，在“application”選項(xiàng)中，選“Genemapper-Genetic”，在“PlateType”選項(xiàng)中選擇“96-well”，在“owner”和“operator”項(xiàng)中分別輸入板所有者和操作者的名字，點(diǎn)擊“OK”按鈕。電泳在“Runscheduler”工具欄中，點(diǎn)擊“Search”按鈕，選中已編輯好的電泳板，點(diǎn)擊樣品板，使電泳板和樣品板關(guān)聯(lián)，然后點(diǎn)擊工具條中左上角的綠色三角按鈕，開始電泳。等位基因數(shù)據(jù)采集數(shù)據(jù)格式樣品每個SSR位點(diǎn)的等位基因采用擴(kuò)增片段大小的形式表示。變性聚丙烯凝膠電泳與銀染檢測將待測樣品擴(kuò)增片段的帶型和泳動位置與對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行比較，與待測樣品相同的標(biāo)準(zhǔn)樣品的片段的大小即為待測樣品該引物位點(diǎn)的等位基因擴(kuò)增片段大小。毛細(xì)管電泳熒光檢測使用DNA分析儀的片段分析軟件，讀出每個位點(diǎn)每個樣品的等位基因擴(kuò)增片段大小數(shù)據(jù)。通過使用標(biāo)準(zhǔn)樣品，消除同型號不同批次間或不同型號DNA分析儀間可能存在的系統(tǒng)誤差。比較標(biāo)準(zhǔn)樣品的等位基因擴(kuò)增片段大小數(shù)據(jù)與表C1中的數(shù)據(jù)。如兩者不一致，其差數(shù)即是系統(tǒng)誤差的大小。從待測樣品的等位基因擴(kuò)增片段數(shù)據(jù)中除去該系統(tǒng)誤差，獲得的數(shù)據(jù)即為待測樣品的等位基因擴(kuò)增片段大小。結(jié)果記錄純合位點(diǎn)的等位基因擴(kuò)增片段數(shù)據(jù)記錄為XXX/XXX，其中XXX為該位點(diǎn)等位基因擴(kuò)增片段大??；雜合位點(diǎn)的等位基因擴(kuò)增片段數(shù)據(jù)記錄為XXX/YYY，其中XXX、YYY分別為該位點(diǎn)上兩個不同的等位基因，小片段數(shù)據(jù)在前，大片段數(shù)據(jù)在后；缺失位點(diǎn)的等位基因數(shù)據(jù)記錄為0/0。示例1：一個品種的一個SSR位點(diǎn)為純合位點(diǎn)，等位基因擴(kuò)增片段大小為120bp，則該品種在該位點(diǎn)上的等位基因擴(kuò)增片段數(shù)據(jù)記錄為120/120。示例2：一個品種的一個SSR位點(diǎn)為雜合位點(diǎn)，兩個等位基因擴(kuò)增片段大小分別為120bp、126bp，則該品種在該位點(diǎn)上的等位基因擴(kuò)增片段數(shù)據(jù)記錄為120/126。判定標(biāo)準(zhǔn)品種鑒定包括對兩個或兩個以上的品種同時進(jìn)行檢測（“直接比較”）和對待測品種進(jìn)行檢測后利用其檢測數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)庫中品種的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對（“數(shù)據(jù)庫比對”）兩種情況。直接比較對待測品種和對照同時進(jìn)行檢測（“直接比較”）時，用附錄C中核心引物檢測，獲得待測品種在這些引物位點(diǎn)的等位基因數(shù)據(jù)，利用這些數(shù)據(jù)進(jìn)行品種間比較：a）品種間差異位點(diǎn)數(shù)≥2，判定為不同品種；b）品種間差異位點(diǎn)數(shù)＝1，判定為近似品種；c）品種間差異位點(diǎn)數(shù)＝0，判定為疑同品種。對于b）和c）的兩種情況，應(yīng)按照GB/T19557.1給出的原則進(jìn)行田間測試，確定品種間在形態(tài)性狀上是否存在明顯差異。數(shù)據(jù)庫比較對待測品種進(jìn)行檢測后利用其檢測數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)庫中品種的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對（“數(shù)據(jù)庫比對”）時，用附錄C中核心引物檢測，獲得待測品種在上述引物位點(diǎn)的等位基因數(shù)據(jù)，利用這些數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)庫中的品種進(jìn)行比較：a）品種間差異位點(diǎn)數(shù)≥2，判定為不同品種；b）品種間差異位點(diǎn)數(shù)＝1，判定為近似品種；c）品種間差異位點(diǎn)數(shù)＝0，判定為疑同品種。對于b）和c）的兩種情況，將這些相近品種或疑同品種與待測品種按照11.1的方法進(jìn)行鑒定。

（規(guī)范性）

儀器設(shè)備及試劑儀器設(shè)備PCR擴(kuò)增儀。電泳槽及配套的制膠附件。高壓電泳儀。水平搖床。膠片觀察燈。電子天平。微量移液器。磁力攪拌器。電磁爐。微波爐。高壓滅菌鍋。酸度計(jì)。臺式高速離心機(jī)。制冰機(jī)。凝膠成像系統(tǒng)或紫外透射儀。DNA分析儀：基于毛細(xì)管電泳，有DNA片段分析功能和數(shù)據(jù)分析軟件，能分辨1個核苷酸的差異。水浴鍋或金屬?。嚎販鼐取?℃。冰箱：最低溫度-20℃。紫外分光光度計(jì)。試劑十六烷基三乙基溴化銨（CTAB）。聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）。三羥甲基氨基甲烷（Tris堿）。濃鹽酸。氫氧化鈉（NaOH）。10×Buffer緩沖液（含Mg2-）。四種脫氧核苷酸：4×dNTP。TaqDNA聚合酶。去離子甲酰胺。溴酚藍(lán)。二甲苯青FF。甲叉雙丙烯酰胺。丙烯酰胺。硼酸。尿素。親和硅烷：97%。剝離硅烷：2%二甲基二氯硅烷。無水乙醇。四甲基乙二胺（TEMED）。過硫酸銨（APS）。冰醋酸。硝酸銀。甲醛。氯仿。異戊醇。異丙醇。DNA分析儀用分子量內(nèi)標(biāo)，LIZ-500分子量內(nèi)標(biāo)。DNA分析儀用丙烯酰胺膠液（POP-4膠）DNA分析儀用光譜校準(zhǔn)基質(zhì)，包括6-FAM、TAMRA、HEX和ROX4種熒光標(biāo)記的DNA片段。DNA分析儀專用電泳緩沖液。

（規(guī)范性）

溶液配制DNA提取溶液的配制0.5mol/L乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）（pH=8.0）溶液稱取186.1gEDTA-Na2溶于800mL蒸餾水中，用固體NaOH調(diào)至pH至8.0，定容至1000mL，高壓滅菌。1mol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸（Tris-HCl）（pH=8.0）溶液稱取60.55gTris堿溶于適量水中，加HCl調(diào)至8.0，定容至500mL，高壓滅菌。0.5mol/L鹽酸（HCl）溶液量取25ml濃鹽酸（36%~38%），加水定容至500mL。DNA提取液稱取CTAB20g，NaCl81.816g，PVP20g，量取1mol/LTris-HCl（pH=8.0）100mL，0.5mol/LEDTA溶液（pH=8.0）40mL，定容至1000mL。5mol/L氯化鈉（NaCl）溶液稱取146g固體NaCl溶于水中，加水定容至500mL。氯仿-異戊醇（24:1）按24:1的比例（體積比）配制混合液。PCR擴(kuò)增溶液的配制dNTP用超純水分別配制A、G、C、T終濃度100mmol/L的儲存液。各取20μL混合，用超純水720μL定容至終濃度2.5mmol/L的工作液。SSR引物根據(jù)合成后引物濃度，用超純水分別配制正向引物和反向引物終濃度均為100μmol/L的儲存液，各取10μL混合，用超純水80μL定容至終濃度10μmol/L的工作液。引物干粉配制前應(yīng)首先快速離心。6×加樣緩沖液稱取溴酚藍(lán)0.125g、二甲苯青0.125g，量取去離子甲酰胺49mL、0.5mol/L的EDTA溶液（pH=8.0）1mL。變性聚丙烯酰胺凝膠電泳溶液的配制40%PAGE膠稱取丙烯酰胺190g和甲叉雙丙烯酰胺10g，定容至500mL。6.0%PAGE膠稱取尿素420g，量取10×TBE緩沖液100mL，40%PAGE膠150mL，定容至1000mL。親和硅烷量取49.75mL無水乙醇和250μL冰醋酸，加水定容至50mL。親和硅烷工作液在1mLBind緩沖液中加入5μLBind原液，混勻。剝離硅烷工作液2%二甲基二氯硅烷。10%過硫酸銨溶液稱取0.1g過硫酸銨溶于1mL超純水中。10×TBE緩沖液稱取Tris堿108g，硼酸55g，量取0.5mol/LEDTA溶于37mL，定容至1000mL。1×TBE緩沖液量取10×TBE緩沖液500mL，加水定容至5000mL。銀染溶液的配制固定液量取5mL冰醋酸、100mL乙醇，加水定容至1000mL。染色液稱取1g硝酸銀，加水定容至1000mL。顯影液量取1000mL蒸餾水，加入10g氫氧化鈉和2mL甲醛。

（規(guī)范性）

核心引物核心引物及參照品種見表C。SSR核心引物及菠蘿參照品種引物名稱引物序列（5’→3’）熒光染料退火溫度℃等位基因bp參照品種PS3tgctccATGCTCTTGTCCTATGGGGTAAGCAAAAGATGCT5’6-FAM53253269262牛奶菠蘿牛奶菠蘿金鉆菠蘿PS5CCCATCTCTCTCCTTTTCCCGTGCTGGCCTTCATCTCCT5’6-FAM55160163170神灣金菠蘿金菠蘿PS18CTGGAACACGCACATAAGGATTATGCACAGCTCCAGGTTG5’6-FAM55266280283286剝粒菠蘿無眼菠蘿臺農(nóng)1號冬蜜菠蘿PS27CAACAATCCCCCAGATCCTAATCCTGCTTGAACGAAGACG5’HEX55159168冬蜜菠蘿黃金菠蘿PS30CTACACCTCCCATTCCCCCTATAGTTGATTCCCGCCCTCT5’HEX52163180182168190黃金菠蘿黃金菠蘿金艷牛奶菠蘿糖心菠蘿PS35tagagcCTTTTCTTTGGGCAggtggtgtAGGCGTAGGTGT5’HEX53267270385X脆無刺卡因神灣PS44CCCCATCTCACGTTCTCTTCAAGCTCCAGCACCTTCCTCT5’HEX55242251245249芒果菠蘿芒果菠蘿糖心菠蘿糖心菠蘿PS46TAAGCCTGATCTCGTcccatGAATTGGGATTCGGAAGGAT5’HEX53207222無眼菠蘿香水菠蘿PS48CCCCAATTCTTCCTCAACCTGGGGAAAAGCTGATCCAAAT5’HEX53173182179香水菠蘿香水菠蘿金鉆菠蘿PS50TTCGAGGAGGACTCGAAAGACGGTTCATGTTTTCCTGAGC5’ROX55170173金菠蘿巴厘PS52ATTACGGCGAACATCACCTCAAATTGGGGGAAAGAACGTC5’ROX55280287289香水菠蘿珍珠珍珠PS56CTCAAGAACATCTGGACCGCACCTCGTCGACCGTCTTCT5’ROX55229240231237239巴厘巴厘XX有刺牛奶菠蘿Everich菠蘿PS64CATAAGAGGCAGAGGCGGtCCGTTTGTTCGTCGACCTAT5’ROX55264275芒果菠蘿剝粒菠蘿PS73gctTTGTTGGCCACTTCTCTGGGGAAAGGagatacccaaa5’TAMRA53230241甜蜜蜜菠蘿西瓜菠蘿PS86AATTAGATTTGAGtgaacccccGGTTCTTTGGcatctctcca5’TAMRA55181187Sweet16菠蘿黃金菠蘿PS94GCTGTACGGGCCGATGTAcgtGTGGGACGATTTAGCTATT5’TAMRA53234240程溪菠蘿蘋果菠蘿PS107CCACGTCACCATACCTTTCCATTGCGGCGTCTTCTGTATC5’TAMRA53276279蘋果菠蘿冬蜜菠蘿PS110CTTCTCCCCTCCCTCCATACGATAGCCGCTCACTCACCTC5’TAMRA56155165163171XX有刺XX有刺牛奶菠蘿牛奶菠蘿

（規(guī)范性）

參照品種名單參照