宏基因組(mNGS)在感染性肺部疾病的臨床應(yīng)用

宏基因組測序在感染性肺部疾病的臨床應(yīng)用20201112ClinicalApplicationofMetagenomicSequencinginInfectiousLungDisease目錄CONTENTS1234背景概述宏基因組研究進展病例分析Part章節(jié)01背景概述BACKGROUNDOVERVIEW背景概述BACKGROUNDOVERVIEW不明原因發(fā)熱分析80%-90%感染性疾病10%FUO發(fā)熱感染性疾病自身免疫性疾病腫瘤不明原因45%-55%20%-30%10%-20%~10%不明原因發(fā)熱（feverofunknownorigin，F(xiàn)UO）發(fā)熱時間持續(xù)超過3周；體溫多次超過38.3℃；超過1周完整的病史詢問、體格檢查和常規(guī)實驗室檢查后仍不能確診。參考《不明原因發(fā)熱與普通發(fā)熱待查的回顧性比較分析》，2014年，臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志背景概述BACKGROUNDOVERVIEW初步檢查明辨方向：感染性？非感染性？培養(yǎng)+藥敏細(xì)菌、真菌、結(jié)核、病毒等培養(yǎng)物：血、骨髓、尿、痰、咽拭物、引流物、各種體液、置入導(dǎo)管等病原血清學(xué)檢查呼吸道病原體IgM/IgG，G/GM/GXM/Mn試驗，CMV、TB-IGRA，EBV、HIV抗體，弓形蟲抗體、寄生蟲抗體等分子生物學(xué)檢查TBGeneX-pert、CMV-DNA、EBV-DNA形態(tài)學(xué)檢查各種標(biāo)本的涂片染色、大便找蟲卵、找霉菌、瘧原蟲等二代測序

宏基因（mNGS）、感染病原體基因檢測panel常規(guī)檢查病原學(xué)檢查風(fēng)濕免疫檢查血液系統(tǒng)檢查腫瘤學(xué)檢查影像學(xué)檢查病理學(xué)檢查背景概述BACKGROUNDOVERVIEW背景概述BACKGROUNDOVERVIEW女性HIV死亡比率14.4%，其余感染性疾病死亡比率12.6%男性HIV死亡比率10.7%，其余感染性疾病死亡比率9.5%背景概述BACKGROUNDOVERVIEW圖6不同地區(qū)肺炎鏈球菌對紅霉素耐藥率圖13不同地區(qū)鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類藥物的耐藥率背景概述BACKGROUNDOVERVIEW

抗感染藥物濫用已成為影響人類健康的主要威脅。我國于2016年發(fā)起“遏制細(xì)菌耐藥國家行動計劃(2016-2020年)”但避免抗感染藥物濫用、遏制細(xì)菌耐藥的關(guān)鍵在于感染性疾病病原菌的早期、快速、精準(zhǔn)診斷。

圖1、2特殊與重要耐藥細(xì)菌檢出率分析對頭孢噻肟耐藥大腸埃希菌甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌亞胺培南耐藥鮑曼不動桿菌亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌萬古霉素耐藥屎腸球菌青霉素耐藥肺炎鏈球菌碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌2018年全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測報告.Part章節(jié)02宏基因組METAGENOME宏基因組METAGENOME廣泛應(yīng)用于人體微生物與疾病研究領(lǐng)域；在臨床產(chǎn)前診斷、癌癥個體化治療領(lǐng)域快速推廣2013/11IlluminaMiseqDX通過美國FDA認(rèn)證2014/03衛(wèi)計委啟動無創(chuàng)唐篩等二代測序檢測臨床申報2015/01衛(wèi)計委發(fā)布《遺傳病相關(guān)個體化醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)指南（試行）》《測序技術(shù)的個體化醫(yī)學(xué)檢測應(yīng)用技術(shù)指南（試行）》2015/02衛(wèi)計委公布首批基因測序臨床試點單位2015/07衛(wèi)計委發(fā)布《藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術(shù)指南（試行）》《腫瘤個體化治療檢測技術(shù)指南（試行）》病原微生物高通量測序臨床檢測？宏基因組METAGENOME宏基因組METAGENOME宏基因組METAGENOME研究進展RESEARCHPROGRESSAJRCCMArticlesinPress.Publishedon05-May-2017as10.1164/rccm.201703-0537LE宏基因組METAGENOME宏基因組檢測的優(yōu)勢快檢測周期準(zhǔn)敏感性與特異性全種類與數(shù)量實驗室周轉(zhuǎn)周期<24h1、采用PCR-free建庫技術(shù)，避免PCR引入的偏向性和污染；2、優(yōu)化核酸提取方案，解決真菌和分枝桿菌難破壁，檢出率低的問題；3、采用Matridx-Spike質(zhì)控技術(shù)，每個樣本設(shè)立獨一內(nèi)標(biāo)，避免交叉污染1、覆蓋16000余種病原體；2、報告表型明確、提示顯著臨床指導(dǎo)意義的耐藥基因；3、DNA+RNA可同時檢測，不放過任何潛在病原體。技術(shù)優(yōu)勢Part章節(jié)03研究進展RESEARCHPROGRESS研究進展RESEARCHPROGRESS2016年美國FDA發(fā)布mNGS感染檢測產(chǎn)品指南(草案)2018年mNGS寫入中國成人HAP與VAP診斷和治療指南

2018年mNGS可用于兒童呼吸道感染診斷(細(xì)菌、病毒)2019年mNGS在急危重癥感染應(yīng)用的專家共識宏基因mNGS項目迅速被臨床認(rèn)可研究進展RESEARCHPROGRESS研究進展RESEARCHPROGRESS

MoranLosada等運用臨床宏基因組學(xué)的方法檢測不同年齡階段的囊性肺纖維化患者的誘導(dǎo)痰液樣本證實99%的呼吸道微生物是數(shù)百種細(xì)菌主要以銅綠假單胞菌及金黃色葡萄球菌為主真菌及病毒僅占呼吸道微生物的1%左右，真菌主要為念珠菌和曲霉菌，病毒主要為腺病毒和皰疹病毒該研究同時明確每例呼吸道樣本中每種微生物的豐度。研究進展RESEARCHPROGRESS

Langelier等納入22例因下呼吸道感染入院的骨髓移植患者，運用臨床宏基因組學(xué)的方法檢測每位患者250μl的肺泡灌洗液樣本，結(jié)果顯示急性呼吸道感染的骨髓移植患者肺部存在HCOV-229E、HRV-A、HHV-6、CMV、HSV、EBV、人乳頭瘤病毒及扭矩特諾病毒等多種病毒，同時存在少見的致病性細(xì)菌：輕型鏈球菌及棒狀桿菌，且細(xì)菌與病毒共存患者臨床癥狀明顯較重。研究進展RESEARCHPROGRESSmNGS在呼吸道感染診斷中的臨床研究mNGS用于檢測92例下呼吸道感染、急性呼吸衰竭成人的氣管抽吸液樣本，檢出率大大超過傳統(tǒng)方法。Langelieretal.PNAS,2018研究進展RESEARCHPROGRESS重癥肺炎研究N=178例，研究mNGS早期提供病原學(xué)證據(jù)和ICU重癥肺炎患者生存情況：通過mNGS早期明確診斷后，臨床據(jù)此結(jié)果調(diào)整治療方案，患者28天和90天的生存率均有提高；與傳統(tǒng)方法相比，mNGS可以提供更快速準(zhǔn)確的病原學(xué)結(jié)果，尤其是對苛養(yǎng)的肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、產(chǎn)黑色普氏菌診斷價值明顯，同時在混合感染的診斷上也具有明顯優(yōu)勢。研究進展RESEARCHPROGRESS

相對于傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)技術(shù)，臨床宏基因組學(xué)在呼吸道樣本微生物診斷的特異性高達(dá)99.8%~100%；腦脊液樣本中，臨床宏基因組學(xué)的微生物診斷敏感性和特異性分別達(dá)到84.3%和93.7%。研究進展RESEARCHPROGRESS臨床宏基因組檢測適應(yīng)癥病情危重需要盡快明確病原體特殊病人如免疫抑制宿主、合并基礎(chǔ)疾病、反復(fù)住院的重癥感染患者需要盡快明確病原體傳統(tǒng)微生物檢測技術(shù)反復(fù)陰性且治療效果不佳疑似新發(fā)病原體、臨床上提示可能有一定的傳染性疑似特殊病原體感染長期發(fā)熱和/或伴有其他臨床癥狀、病因不明的感染項目送檢要求RESEARCHPROGRESS臨床表現(xiàn)樣本類型樣本量容器肺部感染：不明肺炎、胸痛、胸腔積水、胸透異常肺泡灌洗液、胸水、肺部組織、痰液、咽拭子肺泡灌洗液、胸水、痰液：3ml肺部組織：>3mm*5mm咽拭子：>1拭子無菌帶旋蓋腦部感染：神經(jīng)性癥狀腦脊液2ml無菌帶旋蓋器官膿腫膿腫抽液、體液、人體組織2ml無菌帶旋蓋骨髓炎組織、抽液2ml無菌帶旋蓋風(fēng)濕炎、關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)抽液2ml無菌帶旋蓋傷口長期無法愈合傷口滲出液>1個拭子拭子保存液組織部位感染組織>3mm*5mm無菌帶旋蓋不明原因發(fā)熱、血流感染血液宏基因組檢測：4mlEDTA抗凝管項目介紹RESEARCHPROGRESS

基于二代高通量測序技術(shù)，對患者感染的病原體進行快速、高效的鑒定。主要是通過測序、數(shù)據(jù)清洗、錯誤探查和數(shù)據(jù)庫比對分析等一系列操作，獲得疑似病源微生物的種屬信息，并經(jīng)過權(quán)威臨床微生物專家的深度解讀，提供全面深入的分析檢測報告并輔助臨床診斷和治療決策。醫(yī)囑項目檢驗指標(biāo)病原體臨床意義標(biāo)本采集報告時間感染病原體宏基因組檢測病原體DNA細(xì)菌8000+真菌2000+DNA病毒2000+寄生蟲1000+衣原體100+支原體100+螺旋體100+立克次體100+病原體感染種類診斷見標(biāo)本采集要求3-5個工作日病原體感染種類診斷見標(biāo)本采集要求感染病原體宏基因組檢測(加強版)病原體DNA同上+RNA病毒3-5個工作日耐藥性檢測項目介紹可能原因：1、診斷錯誤：肺不張、肺栓塞、肺出血、新生物等；2、臨床樣本未采集到病原體，不是病灶部位標(biāo)本；3、抗生素使用使臨床樣本內(nèi)的病原豐度降低至檢測限以下；4、病原為RNA病毒，但是只做了DNA。臨床懷疑是感染，但mNGS檢測為陰性可能原因：1、抗生素使用不對；2、并發(fā)癥：肺膿腫或積膿、隱匿性的感染、藥物熱等；3、診斷錯誤：肺不張、肺栓塞、肺出血、新生物等；4、耐藥。依據(jù)mNGS檢測結(jié)果去用藥，但治療無反應(yīng)？mNGS結(jié)果如何結(jié)合臨床進行評判?檢出的病原體：報告只能給出病原體，是定值菌、背景菌還是致病菌，需要結(jié)合臨床；有無臨床感染證據(jù)：有無發(fā)熱，感染的癥狀、體征；實驗室檢查：結(jié)合患者的血象、血沉、CRP、PCT、IL-6，鏡檢結(jié)果，培養(yǎng)結(jié)果，血清學(xué)檢查；結(jié)合影像學(xué)改變：影像學(xué)改變是感染的重要證據(jù)；檢測方法：mNGS技術(shù)的方法。mNGS眾多的陽性結(jié)果（一堆病原體）如何解讀？背景常見菌：葡萄球菌、丙酸桿菌、莫拉菌、棒狀桿菌、嗜血桿菌、羅氏菌屬、普氏菌屬、纖毛菌屬檢測陽性≠致病病因陰性報告價值1、多病原體列表展示的優(yōu)勢作用在于提供可能的有效線索；2、開發(fā)特征基因數(shù)據(jù)庫和大樣本背景數(shù)據(jù)積累，將會進一步明確檢出病原與疾病的關(guān)聯(lián)性。1、治療前：結(jié)合病人情況排除感染或病原體本身含量很低；2、治療后：用藥后取樣導(dǎo)致病原體含量降低。嚴(yán)格致病病原體：如結(jié)核、奴卡菌、流感病毒、曲霉、支原體等，可考慮為致病病原；條件致病菌：銅綠、鮑曼、肺克、鏈球菌等，要看測到的序列數(shù)，以及排名，結(jié)合臨床來判斷；多種病原體混合感染：多病原感染，或呼吸道分泌物、腸道分泌物開放體系本身的微生物多樣性等原因會導(dǎo)致多種病原體檢出；常見定值菌：一般不考慮致病性，除非序列數(shù)特別高；罕見、特殊病原