煙草上b型煙粉虱對(duì)煙蚜生理適應(yīng)差異的響應(yīng)

煙草上b型煙粉虱對(duì)煙蚜生理適應(yīng)差異的響應(yīng)

煙虱子是世界上的重要害蟲，有20多種生物類型。其中，b型煙虱是中國的重要外來入侵害蟲。自20世紀(jì)90年代該蟲侵入我國后,迅速傳播蔓延,已成為多種植物上的害蟲優(yōu)勢種,給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來嚴(yán)重的損失。目前,在許多國家和地區(qū)已發(fā)現(xiàn)B型煙粉虱可競爭取代非B型煙粉虱和溫室白粉虱的現(xiàn)象(TsuedaandTsuchida,1998,PascualandCallejas,2004)。昆蟲與植物存在協(xié)同進(jìn)化關(guān)系,植物在進(jìn)化過程中可對(duì)植食性昆蟲形成多種防御機(jī)制,也是植物在遭受植食性昆蟲危害后所表現(xiàn)出的防御特性(Haukioja,1990)。當(dāng)昆蟲感知到植物的防御變化時(shí),一些相應(yīng)的反防御策略也隨之產(chǎn)生(Walling,2008),其中生理適應(yīng)機(jī)制是其重要的方面。保護(hù)酶和消化酶這兩類重要酶系,在維持昆蟲正常的生理生化代謝方面具有重要作用,因此常被用來作為衡量昆蟲生理適應(yīng)能力的指標(biāo)之一(Lozinskayaetal.,2004)。研究表明昆蟲對(duì)寄主植物的適應(yīng)差異與這兩類酶的活性改變有關(guān)(Ashidaetal.,1990;Zhu-Salzmanetal.,2003)。徐艷聆等(2006)研究發(fā)現(xiàn)亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis取食轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲玉米后,類胰蛋白酶活性顯著高于對(duì)照,認(rèn)為這一機(jī)制可能與亞洲玉米螟對(duì)Bt的適應(yīng)性有關(guān)。陳建明等(2002)研究發(fā)現(xiàn)白背飛虱取食水稻抗蟲品種時(shí),蟲體內(nèi)SOD和CAT活性明顯增加。作者在前期研究中發(fā)現(xiàn),B型煙粉虱在煙草上對(duì)煙蚜具有明顯的種間競爭優(yōu)勢,室內(nèi)試驗(yàn)證明,B型煙粉虱為害的煙草對(duì)隨后取食的煙蚜的存活率、生長發(fā)育和繁殖均有顯著的不利影響(未發(fā)表數(shù)據(jù))。同為韌皮部取食的昆蟲B型煙粉虱和煙蚜,取食B型煙粉虱為害的煙草后,其生理適應(yīng)性是否存在差異?二者的生理適應(yīng)性是否與體內(nèi)保護(hù)酶和消化酶活性的變化有關(guān)?探明這些問題對(duì)進(jìn)一步揭示外來入侵害蟲B型煙粉虱的入侵機(jī)制和對(duì)煙蚜的競爭優(yōu)勢均有重要意義。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)品種sicaeB型煙粉虱Bemisiatabaci和煙蚜Myzuspersicae采自山東省泰安市郊甘藍(lán)植株上,轉(zhuǎn)接于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室內(nèi)K326煙草品種上連續(xù)飼養(yǎng)2代以上、繁殖建立實(shí)驗(yàn)種群。該種群經(jīng)北京市農(nóng)林科學(xué)院線粒體DNACOⅠ基因序列鑒定為B生物型。1.2塑料托盤育苗煙草品種為K326,由國家煙草北方育種中心提供。在玻璃溫室中采用塑料托盤育苗,待煙苗長至3～4葉期時(shí),移入花盆(Φ=12cm,h=10cm),每盆1株,網(wǎng)罩下培養(yǎng),生長至有5張展開葉時(shí)供試驗(yàn)用。1.3煙草植株生物量測定選取上述生長一致的煙草植株(有5張展開葉),每6株放在一個(gè)罩籠內(nèi)(50cm×50cm×50cm),按每株200頭左右接入煙粉虱成蟲(雌雄比約為1∶1),產(chǎn)卵24h后將成蟲移除,保留蟲卵,待卵孵化并多數(shù)發(fā)育至2～3日齡的3齡若蟲時(shí)供測定。此時(shí)煙草植株生長至有7～8個(gè)伸展葉片,其中下部1～4葉為帶蟲葉片,從第5葉向上均為無蟲葉片,第6～8張葉片均表現(xiàn)出葉綠素減少,葉脈明顯變白,將之稱為系統(tǒng)白脈葉片。選下部葉片上煙粉虱若蟲達(dá)6～8頭/cm2煙草30株為材料,進(jìn)行再接蟲試驗(yàn)。以籠罩無蟲植株作為對(duì)照。試驗(yàn)在恒溫養(yǎng)蟲室中進(jìn)行,溫度為23±2℃,相對(duì)濕度為75%±5%,光周期為L∶D=12∶12。1.4煙粉病蟲苗/煙/魚成蚤建立酶系統(tǒng)分別在經(jīng)B型煙粉虱前侵染的煙草植株的系統(tǒng)白脈葉片(從下往上數(shù)的第6葉位)上和對(duì)照無蟲植株的相應(yīng)葉位上,用小葉籠分別接入同一種群羽化后2～3d的煙粉虱成蟲(雌雄比約1∶1)、每個(gè)葉籠約50頭,以及1～2日齡的煙蚜無翅成蚜、每個(gè)葉籠20頭。待其取食6,12,24,48和72h時(shí),選取試蟲制備酶液。各處理和對(duì)照重復(fù)3次,每重復(fù)3株煙草。試驗(yàn)在恒溫養(yǎng)蟲室中進(jìn)行,溫度為23±2℃,相對(duì)濕度為75%±5%,光周期為L∶D=12∶12。1.5酶源的制備分別取煙粉虱成蟲100頭或煙蚜無翅成蚜20頭于勻漿器內(nèi),加入1mL0.04mol/L(pH=7.0)磷酸緩沖液,在冰浴下勻漿,再將勻漿液置于4℃,5000r/min下離心10min,取上清液作酶源。每一樣品重復(fù)3次。1.6光催化機(jī)反應(yīng)參照李周直(1994)的方法。在3.6mL反應(yīng)液中,含0.05mol/L磷酸緩沖液(pH=7.0)2.3mL,13.37mmol/L蛋氨酸0.2mL,77.12μmol/L氮藍(lán)四唑(NBT)0.5mL,0.1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)0.5mL和0.1mL酶液,最后加0.2mmol/L核黃素0.4mL。置于4000lux光照條件下進(jìn)行光化學(xué)反應(yīng),反應(yīng)溫度25℃,15min后用黑暗終止反應(yīng),立即在560nm下比色,重復(fù)3次。SOD活性按以下公式進(jìn)行計(jì)算:SOD活性=(OD560(不加酶)?OD560(加酶))×100OD560(不加酶)×加酶液量×粗酶液蛋白含量=(ΟD560(不加酶)-ΟD560(加酶))×100ΟD560(不加酶)×加酶液量×粗酶液蛋白含量1.7比色法制備雙環(huán)[3.2.2]甲基苯磺酸酯2.3和5.2.3和5.2.3.4和5.2.3參照李周直(1994)的方法。在5.2mL反應(yīng)液中,含0.2mol/LPBS緩沖液(pH6.0)2.1mL,0.12mol/L愈創(chuàng)木酚2mL,0.1mol/LH2O21mL和0.1mL酶液,于25℃下反應(yīng)10min后,立即在470nm下比色,重復(fù)3次。酶活力以O(shè)D/(mgpro·min)表示。1.8蛋白質(zhì)含量測定參照馮從經(jīng)等(2004)方法并略為改進(jìn)。取0.2mol/L鄰苯二酚1.5mL,0.05mol/L磷酸緩沖液(pH6.8)1.5mL,加入0.1mL酶液于試管中混勻,并于25℃水浴中振動(dòng)反應(yīng)15min,于420nm處比色,重復(fù)3次,并測定酶液中蛋白質(zhì)含量。酶活力以O(shè)D/(mgpro·min)表示。1.9麥芽糖活性測定采用二硝基水楊酸法并略加改進(jìn)(蔣傳葵等,1982)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:首先配制濃度為1mg/mL的麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別稀釋至0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9和1mg/mL,依次取上述溶液0.2mL于離心管中,再加入2mLDNS顯色劑在沸水中煮沸顯色5min,冷卻后加入蒸餾水2mL于520nm處比色,重復(fù)3次,并確定OD值與麥芽糖含量之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系?；钚詼y定:取勻漿粗酶液0.2mL,加當(dāng)天配制的1%淀粉溶液2mL,于25℃溫浴3min后立即加2mLDNS顯色劑在沸水中煮沸顯色5min,冷卻后于520nm處比色,重復(fù)3次。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出生成的麥芽糖的量(μg),淀粉酶活性以μg/(mgpro·min)表示。1.10酪氨酸微生物活性測定采用Folin-酚試劑法并略加改進(jìn)(朱儉等,1981)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:首先配制濃度為1mg/mL的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別稀釋至0.02,0.04,0.06,0.08,0.16,0.32和0.64mg/mL,依次取上述溶液1mL于離心管中,加入5mL0.5mol/L碳酸鈉,1mLFollin-酚試劑,在37℃水浴中顯色15min,于680nm處比色,重復(fù)3次,并確定OD值與酪氨酸含量之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系?；钚詼y定:取制備好的酶液0.2mL,在37℃水浴中預(yù)熱3～5min,再加入1mL預(yù)熱到37℃的0.5%酪蛋白溶液,混勻后置于37℃水浴中加熱15min。加入3mL10%三氯乙酸,混合后離心。取上清液1mL,加5mL0.5mol/L碳酸鈉,1mLFollin-酚試劑,在37℃水浴中顯色15min,于680nm處比色,重復(fù)3次。從建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對(duì)應(yīng)的酪氨酸微克數(shù),確定酶活力大小。酶活性以μg/(mgpro·min)表示。1.11蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色方法(Bradford,1976)。吸取原酶液0.1mL于試管中,加入5mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液,對(duì)照管中則加入0.1mL磷酸緩沖液代替酶液,混勻后于室溫下放置5min,在595nm下比色,重復(fù)3次,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出蛋白質(zhì)含量(mg)。1.12數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析各酶活測定數(shù)據(jù)使用SPSS軟件16.0版本兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)法進(jìn)行方差分析(P<0.05)。2結(jié)果與分析2.1煙嗪對(duì)b型煙粉銻前侵的煙草體內(nèi)sod活性的影響由圖1(A)看出,B型煙粉虱成蟲取食其前侵染的煙草后,5個(gè)時(shí)間處理的成蟲體內(nèi)SOD活性均明顯高于對(duì)照;其中取食6h的SOD活性與對(duì)照相比差值最大,達(dá)1.62倍。表明B型煙粉虱前侵染的煙草能顯著提高自身SOD活性。從圖1(B)看出,煙蚜取食B型煙粉虱前侵染的煙草后,6和48h兩個(gè)處理的煙蚜體內(nèi)SOD活性與對(duì)照差異不明顯;12h處理的SOD活性明顯低于對(duì)照,僅為對(duì)照的0.67倍;24和72h兩個(gè)處理的SOD活性略高于對(duì)照。表明煙蚜取食B型煙粉虱前侵染的煙草對(duì)其SOD活性的有短時(shí)間的抑制作用。2.2不同處理對(duì)煙草pod活性的影響由圖2(A)看出,B型煙粉虱成蟲取食其前侵染的煙草,6,48和72h3個(gè)處理的成蟲體內(nèi)POD活性均明顯高于對(duì)照。6h處理的POD活性是對(duì)照的2.57倍;12和24h處理的POD活性略高于對(duì)照,但差異不明顯。表明B型煙粉虱前侵染的煙草能顯著增加其自身POD活性。由圖2(B)中看出,煙蚜取食B型煙粉虱前侵染的煙草,除取食24h處理的POD活性高于對(duì)照外,其他4個(gè)處理時(shí)間的POD活性明顯低于對(duì)照,其中最大抑制率出現(xiàn)在72h,處理的POD活性僅為對(duì)照的0.36倍。表明煙蚜取食B型煙粉虱前侵染的煙草對(duì)其POD抑制作用顯著。2.3煙草體內(nèi)ppo活性測定由圖3(A)看出,B型煙粉虱成蟲取食其前侵染的煙草,5個(gè)時(shí)間處理的成蟲體內(nèi)PPO的活性均顯著高于對(duì)照,兩者相差可達(dá)1.73～2.71倍。表明B型煙粉虱前侵染的煙草能顯著增加其自身體內(nèi)PPO活性。由圖3(B)看出,煙蚜取食B型煙粉虱成蟲前侵染的煙草,5個(gè)時(shí)間處理蚜蟲體內(nèi)PPO的活性均略高于對(duì)照,12,48和72h處理與對(duì)照差異均不明顯,表明煙蚜取食B型煙粉虱前侵染的煙草對(duì)其體內(nèi)PPO活性影響不大。2.4對(duì)比兩組患者的血壓由圖4(A)看出,B型煙粉虱成蟲取食其前侵染的煙草,5個(gè)時(shí)間處理成蟲體內(nèi)淀粉酶活性均明顯高于對(duì)照。表明B型煙粉虱成蟲取食其前侵染的煙草對(duì)其體內(nèi)淀粉酶活性有明顯的增強(qiáng)作用。由圖4(B)看出,煙蚜取食B型煙粉虱成蟲前侵染的煙草,12～72h的4個(gè)時(shí)間處理其體內(nèi)淀粉酶的活性均明顯低于對(duì)照,表明煙蚜取食B型煙粉虱成蟲前侵染的煙草對(duì)其淀粉酶活性有明顯的抑制作用。2.5煙草對(duì)b型煙粉銻成蟲對(duì)其體內(nèi)蛋白酶活性的影響由圖5(A)看出,B型煙粉虱成蟲取食其前侵染的煙草,5個(gè)時(shí)間處理成蟲體內(nèi)蛋白酶的活性均顯著高于對(duì)照,最大酶活高峰出現(xiàn)在24h,為對(duì)照的1.57倍。表明B型煙粉虱成蟲取食其前侵染的煙草對(duì)其體內(nèi)蛋白酶活性有顯著的增強(qiáng)作用。由圖5(B)看出,煙蚜取食B型煙粉虱成蟲前侵染的煙草,12～72h的4個(gè)時(shí)間處理體內(nèi)蛋白酶的活性均明顯低于對(duì)照,其中12h處理的蛋白酶活性最低,僅為對(duì)照的0.39倍。表明煙蚜取食B型煙粉虱成蟲前侵染的煙草對(duì)其體內(nèi)的蛋白酶有顯著的抑制作用。3討論3.1含氮類腐胺對(duì)水稻抗蟲基因活性的影響昆蟲體內(nèi)有許多重要的酶系,它們?cè)诰S持正常的生理生化代謝方面發(fā)揮著重要作用。各種酶系活性發(fā)生不同程度的變化可能是昆蟲快速適應(yīng)植物防御反應(yīng)的一個(gè)重要方面(Ding,2001)。SOD,POD和PPO是昆蟲體內(nèi)3種重要的保護(hù)酶,與昆蟲避免自由基傷害和昆蟲的免疫作用相關(guān)(李周直等,1994)?，F(xiàn)已有很多研究發(fā)現(xiàn),昆蟲體內(nèi)保護(hù)酶的活性與昆蟲抗逆性等有關(guān)。王楠等(2008)研究發(fā)現(xiàn),將生物體內(nèi)普遍存在的具有生物活性的含氮堿類腐胺添加到人工飼料中后能夠顯著提高小菜蛾3齡幼蟲體內(nèi)CAT,SOD和POD比活力,并且都能達(dá)到2倍以上。Ding等(2001)報(bào)道美國白蛾Hyphantriacunea幼蟲取食轉(zhuǎn)抗蟲基因的白楊,其體內(nèi)的SOD和POD活性顯著升高,但在達(dá)到峰值后又迅速降低。呂仲賢等(1997)報(bào)道,褐飛虱在含有抗蟲基因的水稻品種上取食至第3代以后其主要生物學(xué)參數(shù)與取食感蟲品種者基本相同,與此相對(duì)應(yīng)的是從第3代開始褐飛虱體內(nèi)SOD和CAT的活性明顯增加。本研究發(fā)現(xiàn),B型煙粉虱取食其前侵染的煙草,其體內(nèi)SOD,PPO和POD3種保護(hù)酶活性顯著增加,但對(duì)取食同樣煙草植株的煙蚜體內(nèi)這3種保護(hù)酶的活性卻有一定程度的抑制作用或作用不明顯。證明B型煙粉虱清除體內(nèi)活性氧和自我免疫的保護(hù)能力要顯著高于煙蚜,這可能是B型煙粉虱在煙草上與煙蚜的種間競爭中占據(jù)優(yōu)勢的一個(gè)重要原因。在研究中作者還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)有趣的現(xiàn)象,即煙粉虱的3種保護(hù)酶活性都在取食其前侵染的煙草6h時(shí)的活性最高,而煙蚜的3種保護(hù)酶卻在取食24h時(shí)的活性最高,其原因可能是煙粉虱感受逆境的反應(yīng)比煙蚜更快,也是體現(xiàn)煙粉虱適應(yīng)能力強(qiáng)的另一種表達(dá)形式。3.2-淀粉酶的活性蛋白酶和淀粉酶是昆蟲體內(nèi)兩種重要的消化酶,二者能夠分解和消化蛋白和淀粉等營養(yǎng)物質(zhì),以維持昆蟲正常的生長發(fā)育。目前已發(fā)現(xiàn)幾十種來自植物的能抑制昆蟲消化酶活性或消化能力的物質(zhì)。其中植物體內(nèi)的蛋白酶抑制劑和淀粉酶抑制劑就是由誘導(dǎo)產(chǎn)生的抑制昆蟲消化酶活性的物質(zhì)。目前涉及此方面的研究較多,如馬鈴