青島地區(qū)居民魚(yú)類過(guò)敏反應(yīng)及小清蛋白的研究

青島地區(qū)居民魚(yú)類過(guò)敏反應(yīng)及小清蛋白的研究

隨著人們追求健康生活，用豐富的營(yíng)養(yǎng)來(lái)享受生活，越來(lái)越多的人喜歡。我國(guó)水產(chǎn)品消費(fèi)總量自2000年以來(lái)保持穩(wěn)步增長(zhǎng),2009年我國(guó)水產(chǎn)品消費(fèi)達(dá)到1341.71萬(wàn)t,同比增長(zhǎng)4.90%,人均消費(fèi)量為10.05kg,是1985年人均消費(fèi)量的3.4倍,但是魚(yú)類也被認(rèn)為是八大易引發(fā)食物過(guò)敏癥狀的食物種類之一。流行病學(xué)的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示,在美國(guó)有4%左右的成年人受到食物過(guò)敏的影響,其中,魚(yú)類過(guò)敏占到了10%以上。特別是近年來(lái),魚(yú)類作為一種重要的食品原料應(yīng)用于調(diào)理食品中,不明確的標(biāo)注和國(guó)際貿(mào)易的發(fā)展使得魚(yú)類過(guò)敏的風(fēng)險(xiǎn)大大增加,對(duì)魚(yú)類過(guò)敏原的鑒定及其過(guò)敏機(jī)制的探討變得愈發(fā)重要。有研究報(bào)道,不同品種魚(yú)的過(guò)敏原之間存在嚴(yán)重的交叉反應(yīng),但大部分研究主要針對(duì)歐美等國(guó)外消費(fèi)的魚(yú)類產(chǎn)品,由于地域差異,我國(guó)對(duì)魚(yú)類的主要消費(fèi)品種同歐美地區(qū)存在著較大差異。目前針對(duì)我國(guó)消費(fèi)量較大的魚(yú)類過(guò)敏原的交叉反應(yīng)還鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)采集青島地區(qū)魚(yú)類過(guò)敏患者血清,通過(guò)蛋白質(zhì)電泳、免疫印跡、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)等方法對(duì)青島地區(qū)常見(jiàn)的阿拉斯加狹鱈(Theragrachatcogramma)、藍(lán)點(diǎn)馬鮫(Scomberomrusniphonius)、大黃魚(yú)(Larimichthyscrocea)、真鯛(Pagrosomusmajor)、鮭(Salmosalar)、大菱鲆(Scophthatmusmaximus)及鯉(Cyprinuscarpio)等7種魚(yú)分別進(jìn)行過(guò)敏原鑒定分析,并探討它們之間的交叉反應(yīng),為提高食品中魚(yú)類過(guò)敏原的檢測(cè)水平,改進(jìn)過(guò)敏疾病的診斷方法提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)試劑與儀器實(shí)驗(yàn)材料阿拉斯加狹鱈(俗稱鱈)、藍(lán)點(diǎn)馬鮫(俗稱鲅)、大黃魚(yú)、真鯛(俗稱加吉魚(yú))、鮭(俗稱三文魚(yú))、大菱鲆、鯉(購(gòu)于青島本地水產(chǎn)品市場(chǎng),活品或冰鮮品);PVDF膜(0.45μm,Solarbio公司);化學(xué)發(fā)光底物(PierceECL蛋白印跡底物,ThermoScientific公司);三羥甲基氨基甲烷(Tris,青島福林生物化學(xué)公司);二硫蘇糖醇(DTT,Solarbio公司);十二烷基硫酸鈉(SDS,山東愛(ài)博科技貿(mào)易公司);兔抗鲅魚(yú)小清蛋白多克隆抗體(由本實(shí)驗(yàn)室自行制備、親和層析純化);HRP-羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);魚(yú)過(guò)敏患者血清(青島市過(guò)敏疾病防治中心);HRP-羊抗人IgE(Sigma公司);其他試劑如無(wú)特殊說(shuō)明均為分析純。實(shí)驗(yàn)儀器組織搗碎機(jī)(DS-1,上海標(biāo)本模型廠);離心機(jī)(BR4i,Jouan公司);電泳儀(DYY-12,北京六一儀器廠);半干式碳板轉(zhuǎn)印儀(DYCP-40C,北京六一儀器廠);酶標(biāo)儀(MutiskanMK3,ThermoLabsystems公司);天能凝膠成像儀(Tanon4200,上海天能科技有限公司);電泳儀(Model491PrepCell,Bio-rad公司)。紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(TU1810,北京普析儀器有限公司);恒溫振蕩培養(yǎng)箱(ZHWY-2102,上海智城分析儀器制造有限公司)。1.2將阿拉斯加狹鱈肉等量分為3組(A、B、C組),每組100g,A、B組魚(yú)肉分別加入200g提取液T-G(0.1mol/LTris/0.5mol/LGly緩沖液,pH8.7,1mmol/LDTT),C組魚(yú)肉加入200g提取液K-D(1mol/LKCl,0.05%DTT),進(jìn)行勻漿,A、C組4℃振蕩提取14h,結(jié)束后4000r/min離心30min后取上清,沉淀用原方法繼續(xù)提取4h,離心,合并上清進(jìn)行透析,B組45℃振蕩提取14h,4000r/min離心30min后取上清,在沸水浴中攪拌煮沸30min,4000r/min離心30min,收集上清進(jìn)行透析。采用BRADFORD法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,SDS法確定抽提物的蛋白組分,ELISA法確定抽提物的免疫活性,最終確定魚(yú)肉蛋白質(zhì)的抽提方法,其他6種魚(yú)均按照確定的方法提取蛋白。1.3復(fù)合膜對(duì)蛋白質(zhì)凝膠分離、濃縮膠濃度的影響采用LAEMMLI建立的不連續(xù)電泳體系,對(duì)3組阿拉斯加狹鱈蛋白提取液總蛋白組分進(jìn)行比較。分離膠濃度為15%(W/V),濃縮膠濃度為5%(W/V),蛋白樣品稀釋至1mg/mL,用樣品緩沖液處理。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)R-250染色,脫色后采集圖像。1.4-m-四甲基聯(lián)苯胺tmb底物的制備參考文獻(xiàn)的方法并略作改進(jìn),用0.05mol/L碳酸鹽緩沖液(CBS,pH9.6)將3組阿拉斯加狹鱈蛋白提取液稀釋至10μg/mL,100μL/孔于4℃過(guò)夜,含0.1%Tween-20的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌3次,每次5min,將孔內(nèi)剩余液體拍干,下面的洗滌方法相同,加入含1%BSA的PBST,300μL/孔,37℃封閉1.5h,洗滌,加入用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS,pH7.4,稀釋液)稀釋20000倍的兔抗鲅魚(yú)小清蛋白多克隆抗體,100μL/孔,37℃孵育1.5h,洗滌,再加入HRP-羊抗兔IgG(1∶5000),100μL/孔,37℃孵育1h,洗滌。加入四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物溶液,100μL/孔,37℃避光顯色20min后用2mol/LH2SO4(50μL/孔)終止反應(yīng),用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光值OD450。對(duì)比3組提取方法制得的阿拉斯加狹鱈過(guò)敏原的免疫活性。1.5免疫檢測(cè)樣品SDS:同上述方法;免疫印跡:電泳結(jié)束后,采用半干式碳板轉(zhuǎn)印儀,1mA/cm2恒流轉(zhuǎn)印3h,將凝膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)印到PVDF膜上,對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行免疫檢測(cè)。首先,將膜置于5%脫脂奶/PBST(封閉液)中室溫下封閉2h,然后用PBST洗滌3次,每次5min,以下洗滌方法相同。過(guò)敏患者血清(特異性IgE)用50%封閉液稀釋80倍,于室溫下預(yù)孵育1h后,室溫下孵育膜過(guò)夜,洗滌,加入用PBS稀釋1000倍的HRP-羊抗人IgE,室溫下孵育1h,充分洗滌后將PVDF膜用ECL蛋白印跡底物孵育1min后,在天能凝膠成像儀(Tanon4200)中曝光15min成像。1.6蛋白凝膠成像測(cè)定SDS及電轉(zhuǎn)移、封閉步驟同“1.5”,一抗為兔抗鲅魚(yú)小清蛋白多克隆抗體(1∶2000),室溫下孵育1h,二抗為HRP-羊抗兔IgG(1∶5000),室溫下孵育1h,加入ECL蛋白印跡底物后用凝膠成像儀中曝光30min成像。1.7不同家兔的魚(yú)模型在96孔板中加入1μg/mL過(guò)敏原抽提液,100μL/孔,4℃包被過(guò)夜,PBST洗滌3次,每次5min,將孔內(nèi)剩余液體拍干,以下洗滌方法相同;加入1%BSA/PBST,300μL/孔,37℃封閉1.5h,洗滌;陰性組加入兔抗鲅魚(yú)小清蛋白多克隆抗體(一抗)、抑制組一抗中分別加入7種魚(yú)的過(guò)敏原蛋白(100μg/mL),37℃預(yù)孵育1h后100μL/孔加入96孔板,37℃孵育1.5h,洗滌;加入HRP-羊抗兔IgG,100μL/孔,37℃孵育1h,洗滌。加入TMB底物溶液,100μL/孔,37℃避光顯色20min后用2mol/LH2SO4(50μL/孔)終止反應(yīng),用酶標(biāo)儀測(cè)定OD450值,陰性組記做A0,抑制組記做A。計(jì)算抑制率:抑制率(%)=(1-A0/A)×100。2結(jié)果與討論2.1不同提取方法的確定3種提取方法提取獲得的阿拉斯加狹鱈過(guò)敏原蛋白提取液濃度及免疫活性結(jié)果如表1所示,各組阿拉斯加狹鱈蛋白組分SDS結(jié)果見(jiàn)圖1。C組魚(yú)肉總蛋白濃度最高,反應(yīng)過(guò)敏原免疫活性的間接ELISA結(jié)果表明該組免疫活性較高,但SDS分析顯示小清蛋白(～12ku)損失也最大,小清蛋白含量低,這可能是由于小清蛋白等為酸性蛋白質(zhì),易溶解于稀堿性溶液中,而K-D提取液為中性溶液,T-G提取液為堿性溶液,所以C組提取液對(duì)小清蛋白等酸性蛋白的提取效果較A組更高;A、B兩組總蛋白濃度相當(dāng),雖然B提取法抽提到的小清蛋白最多,但除17、36ku左右的蛋白外,其他不耐熱蛋白損失較大,且免疫活性最低;而A組蛋白組分保留最好,不同分子量的蛋白均得以較完整的保留,且具有最高的免疫活性,故最終確定用A組提取方法,即用提取液T-G4℃提取作為提取魚(yú)肉過(guò)敏原的最佳方法。其他6種魚(yú)肉蛋白均用該法提取得到。2.2特異性ige與小清蛋白的表達(dá)利用SDS對(duì)7種魚(yú)的蛋白組分進(jìn)行分析,電泳圖顯示,7種魚(yú)的蛋白提取液所含的蛋白組分分子量從9ku到160ku不等,且在97、50～60、33～41、25～28ku處存在分子量極為相近的蛋白條帶,但22ku以下的蛋白組分差異性較大,小清蛋白(～12ku)的分子量及其亞基組成各不相同(圖2)。將凝膠上的蛋白條帶電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上后,分別利用18份魚(yú)過(guò)敏患者血清對(duì)7種魚(yú)過(guò)敏原蛋白進(jìn)行免疫印跡分析,通過(guò)每種蛋白對(duì)人血清特異性IgE的結(jié)合程度鑒定每種魚(yú)的過(guò)敏原蛋白(圖3)。對(duì)于青島地區(qū)魚(yú)類過(guò)敏患者而言,真鯛主要過(guò)敏原為35～42、51、28～29及18ku的蛋白,少數(shù)患者血清對(duì)94及57ku的蛋白有較輕的陽(yáng)性反應(yīng);阿拉斯加狹鱈主要過(guò)敏原為41、36、33、22及18ku的蛋白,其次為51ku蛋白;鯉主要過(guò)敏原為41及36ku的蛋白,28～29ku處有極微弱的陽(yáng)性反應(yīng)。此外,18#血清對(duì)50ku蛋白反應(yīng)強(qiáng)烈;鮭幾乎每條蛋白都可與特異性IgE相結(jié)合,包括94、60、48、41、39、37、33、29及15ku的蛋白,其中,37～41及29ku的蛋白反應(yīng)最為強(qiáng)烈;藍(lán)點(diǎn)馬鮫主要過(guò)敏原為36、39、41、49、28及58ku的蛋白,少數(shù)患者血清對(duì)15及94ku蛋白也有微弱反應(yīng);大菱鲆主要過(guò)敏原為41、39、37、51、60、17及29ku的蛋白;大黃魚(yú)主要過(guò)敏原為41、37、17、50、58及30ku蛋白,與楊睿等的研究結(jié)果較為接近?？偟膩?lái)說(shuō),對(duì)于青島地區(qū)居民而言,與過(guò)敏原特異性IgE結(jié)合能力較強(qiáng)的是分子量為48～60、33～42、29及17ku左右的蛋白,而并非國(guó)際上普遍認(rèn)為的魚(yú)類主要過(guò)敏原小清蛋白。41ku的蛋白作為一種魚(yú)類主要過(guò)敏原,近年來(lái)屢見(jiàn)報(bào)道。GALLAND等報(bào)道,鱈41ku蛋白是其很重要的過(guò)敏原之一。DASDORES等分析認(rèn)為41及36ku的蛋白分別為糖基化及未糖基化的乙醛磷酸脫氫酶(APDH)。NAKAMURA等對(duì)紅點(diǎn)櫻花鉤吻鮭(Oncorhynchusmasouishikawae)的過(guò)敏原鑒定表明,41ku蛋白是該魚(yú)主要過(guò)敏原,通過(guò)雙向電泳分離發(fā)現(xiàn)41ku處包括兩個(gè)等電點(diǎn)不同的蛋白,經(jīng)液相色譜/質(zhì)譜/質(zhì)譜測(cè)序,分析其為果糖二磷酸醛縮酶A及少量快肌原肌球蛋白。此外,他們還發(fā)現(xiàn),26ku蛋白也是該魚(yú)過(guò)敏原之一,測(cè)序結(jié)果表明其為磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)。而小清蛋白并未出現(xiàn)清晰條帶,這與本文結(jié)果相似。DASDORES等認(rèn)為鱈(Gadusmorhua)中20～24、38、50～51ku蛋白分別為小清蛋白(11.5ku)的二聚體、三聚體及四聚體。而本實(shí)驗(yàn)中,阿拉斯加狹鱈、真鯛、大菱鲆及大黃花魚(yú)的17ku蛋白對(duì)特異性IgE結(jié)合也較強(qiáng),據(jù)FAESTE等對(duì)鱈等23種魚(yú)蛋白提取液的免疫印跡分析發(fā)現(xiàn),該條帶幾乎在所有的魚(yú)中都存在,且可與鱈魚(yú)小清蛋白多抗結(jié)合,可能為小清蛋白的另一種聚合物或與抗小清蛋白IgG存在交叉反應(yīng)。KONDO等發(fā)現(xiàn)94ku的蛋白在金槍魚(yú)及鯖等多種魚(yú)之間也存在著交叉反應(yīng),通過(guò)氨基酸測(cè)序初步判斷其為轉(zhuǎn)鐵蛋白。本研究發(fā)現(xiàn),7種魚(yú)之間的多條蛋白均能引發(fā)其強(qiáng)烈的交叉反應(yīng),每一份魚(yú)過(guò)敏患者血清對(duì)所有7種魚(yú)都存在著不同程度的陽(yáng)性反應(yīng)。值得注意的是,圖1顯示,在煮沸30min后,除17、36ku蛋白及小清蛋白外的很多蛋白已被除去,但小清蛋白濃度確明顯升高。而在高離子濃度(1mol/LKCl溶液)下,94、58、51及18ku蛋白濃度也微乎其微。說(shuō)明在實(shí)際食用時(shí),魚(yú)肉蛋白組分在烹飪過(guò)程中產(chǎn)生變化,有些過(guò)敏原被破壞或分解,從而未能引發(fā)患者的過(guò)敏反應(yīng)。2.3免疫印跡結(jié)果小清蛋白存在于許多種魚(yú)的白色肌肉組織中,是引起魚(yú)類交叉反應(yīng)的最主要的過(guò)敏原之一。故選擇小清蛋白作為研究魚(yú)類交叉反應(yīng)的主要研究對(duì)象。利用兔抗鲅魚(yú)小清蛋白多克隆抗體作為一抗的免疫印跡結(jié)果如圖4所示,由于兔抗是采取純化后的鲅魚(yú)小清蛋白制成,故對(duì)每種魚(yú)的小清蛋白(12ku左右)表現(xiàn)出極高的特異性,而與41ku蛋白基本無(wú)反應(yīng),說(shuō)明APDH與小清蛋白Ca2+結(jié)合區(qū)域同源性極低,與小清蛋白之間不存在交叉反應(yīng)。對(duì)于可能為小清蛋白聚合體的24、38、51ku處,出現(xiàn)了極微弱的陽(yáng)性反應(yīng)條帶?？紤]到IgE免疫印跡結(jié)果,特異性IgE可與這三條帶結(jié)合但未與小清蛋白產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng),而IgG免疫印跡中,小清蛋白多克隆抗體對(duì)這三條帶也未出現(xiàn)較強(qiáng)的陽(yáng)性反應(yīng),可見(jiàn)小清蛋白與其交叉反應(yīng)并不大,因此認(rèn)為尚不能肯定其確實(shí)為小清蛋白的聚合體,但也可能由于聚合形式使鈣結(jié)合區(qū)域與抗體之間發(fā)生了空間位阻,影響了特異性結(jié)合。同時(shí),利用陰性兔血清及兔抗蝦原肌球蛋白多克隆抗體按照相同方法做免疫印跡,結(jié)果均無(wú)陽(yáng)性條帶出現(xiàn)(結(jié)果未展示)。說(shuō)明7種魚(yú)小清蛋白之間交叉反應(yīng)性強(qiáng),小清與其他魚(yú)肉蛋白及蝦原肌球蛋白之間幾乎不存在交叉反應(yīng)。2.4不同種類魚(yú)的小清蛋白交叉反應(yīng)IgG間接ELISA對(duì)7種魚(yú)過(guò)敏原蛋白的交叉反應(yīng)性的結(jié)果如圖5所示,藍(lán)點(diǎn)馬鮫與大菱鲆OD450值最高,鯉最低,其他幾種魚(yú)的OD450值相當(dāng)。抑制性ELISA