分子實驗室手冊

第三篇

實驗部分

第7章配制試劑和緩沖液

第8章貯藏和處理

第9章無菌操作技術(shù)

第七章

配制試劑和緩沖液

Logo確定所需之物

配制試劑與緩沖液1計算所需之物2稀釋儲備的緩沖液3稱量和混合4測定pH值5緩沖液和溶液的儲存溶液滅菌67一、確定所需之物1.熟讀整個試驗程序,寫下所需要用到的試劑。2.確定每一種試劑你要配制多少。3.確定配制直接使用的溶液還是配制高濃度的

儲備液。4.確認(rèn)需要的化學(xué)試劑可以在實驗室里找到。5.如果沒有庫存應(yīng)盡快獲得藥品。

安全性1.清楚你所接觸的每一個藥品的組分及相關(guān)毒

性2.遵照建議處理（手套眼睛保護(hù)櫥罩面罩標(biāo)簽）3.知道如何使用通風(fēng)櫥常見有害試劑丙烯酰胺神經(jīng)毒性，用于蛋白質(zhì)電泳凝膠和測序凝

膠的制備，要戴面罩。溴化乙錠EtBr是一種誘變劑，能嵌入DNA，用于核

酸標(biāo)記。有毒，固體可以刺激皮膚和黏膜。酚

強(qiáng)腐蝕性，可以灼傷皮膚，萃取和配制時應(yīng)使用

通風(fēng)櫥。苯甲基磺酰氟（PMSF）分離蛋白質(zhì)時用于對蛋白水

解酶的抑制，吞咽或通過皮膚吸收都有可能致命十二烷基硫酸鈉（SDS）去垢劑，易燃，尤其對于

鼻腔刺激性強(qiáng)，SDS質(zhì)地光滑蓬松，稱量時要動作

要輕盈和戴面罩。

二、計算所需之物

1.計算物質(zhì)的量濃度2.當(dāng)量濃度（N）

1L水溶液中溶解的溶質(zhì)的用氫的當(dāng)量物除摩爾質(zhì)量3.質(zhì)量分?jǐn)?shù)溶液質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)（W/V）體積分?jǐn)?shù)(V/V)質(zhì)量/質(zhì)量分?jǐn)?shù)(W/W)

三、稀釋儲備的緩沖液

連續(xù)稀釋稀釋前溶液１mg/ml100ul100ul100ul900ul900ul900ul900ul100ul制備酚和酚氯仿酚無色透明，可直接用于分子克隆。

（注意：強(qiáng)腐蝕性，會灼傷皮膚，應(yīng)帶口罩、護(hù)目鏡，穿防護(hù)衣，在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行。）平衡酚使用前，必須將酚平衡到PH>7.8，因為DNA在酸性條件下會進(jìn)入有機(jī)相。酚：氯仿：異戊醇（25:24:1）含等量酚-氯仿-異戊醇的混合物常在抽提核酸的實驗中使用，以除去蛋白質(zhì)。氯仿能夠使蛋白質(zhì)變性，且有助于水相和有機(jī)相分離，異戊醇可以減少萃取過程中產(chǎn)生的泡沫。四.稱量和混合準(zhǔn)備所需

稱量紙稱量器皿刮刀、藥匙干凈的量筒燒杯或三角燒瓶磁力攪拌器和攪拌子處置藥匙和磁力攪拌子的地方擦拭紙蒸餾水稱量1.稱量時戴上手套。2.閱讀瓶上的標(biāo)簽。（是否戴面罩）3.打開天平電源。4.稱量紙及稱量器的重量。5.稱量材料。（能放回藥品瓶中多余的藥品：該物質(zhì)沒有吸濕性；除了干凈的稱量紙及稱量器，沒有接觸過其他物品。）6.藥品倒入燒杯或三角燒瓶中。7.緊緊該上藥品瓶蓋。8.稱量結(jié)束，打掃天平。（不能馬上加水的藥品，用鋁箔或者塑料紙蓋住燒杯口，做上標(biāo)記，放到自己的試驗臺上。）

混合：（對于多數(shù)溶液）

1.加入終體積約80%的水到燒杯中，然后加固體溶質(zhì)。2.輕輕放入磁力攪拌子，確保能有足夠空間自由轉(zhuǎn)動。3.先把燒杯放在磁力攪拌器上，打開低速攪拌開關(guān)，緩慢調(diào)大轉(zhuǎn)速。4.待溶質(zhì)充分溶解后停止攪拌。5.把溶解完全的溶液倒入量筒或燒杯中，測定體積，加溶劑使整個溶液的體積接近所需體積的90%。6.將溶液倒回?zé)蛉瞧恐校{(diào)pH值。7.在燒杯上標(biāo)記好內(nèi)容物。

五、測定pH值

校準(zhǔn)PH計至少兩種PH標(biāo)準(zhǔn)溶液（通常使用PH4和10的標(biāo)準(zhǔn)液。）3~4個50ml的玻璃或塑料藥品杯棉紙校準(zhǔn)PH計1.將電極從浸泡緩沖液中拿出，用蒸餾水沖洗，用棉紙巾小心擦干電極外面的液體。2.倒出約1.5英寸的PH4（或10）的標(biāo)準(zhǔn)溶液，倒在小燒杯中，蓋上瓶蓋，把電極頭浸入燒杯的溶液中。3.按下PH計上的“標(biāo)準(zhǔn)化”按鈕，直到儀器上顯示穩(wěn)定的PH為4。4.按下“待命”按鈕，拿出電極清洗干凈并擦干。5.把PH10的溶液倒入另外的燒杯中，用同樣方法標(biāo)定。6.標(biāo)定后清洗擦干，把電極插回保存液中保存。7.測定標(biāo)準(zhǔn)化緩沖液的PH。測定PH1.在磁力攪拌器上攪拌準(zhǔn)備調(diào)PH的溶液。2.將電極從保存液中取出，用蒸餾水沖洗干凈，棉紙擦干，PH計的狀態(tài)應(yīng)保持在“待命”。3.把電極頭進(jìn)入需測定的溶液中，并確定攪拌子不會碰撞到電極。4.將PH計上的轉(zhuǎn)換開關(guān)從“待命”轉(zhuǎn)到“PH測定”。5.讀取數(shù)值，并用NaOH或HCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。6.將PH計的功能調(diào)回到“待命”。7.將電極拿出，用蒸餾水沖洗干凈并用棉紙擦干。8.將電極浸入儲存緩沖液。9.把調(diào)好PH的溶液倒入量筒或容量瓶，定容。10.把定容的溶液倒入有蓋的玻璃瓶或塑料瓶中密封。11.在瓶子上貼上標(biāo)簽，滅菌。六、溶液滅菌高壓滅菌大多數(shù)緩沖液，不明確的細(xì)菌和酵母培養(yǎng)基。不能高壓滅菌含有去垢劑的緩沖液，如10%SDS，會因沸騰溢出。有機(jī)溶劑，包括酚。含有熱不穩(wěn)定的成分，如血清、維生素、抗體、BSA等蛋白質(zhì)。哺乳動物、植物和昆蟲的培養(yǎng)基。含HEPES的溶液。含有DTT二硫蘇糖醇或BME的溶液。高壓滅菌

1.將待滅菌器材、試劑放入高壓蒸鍋內(nèi)，裝液體的瓶中液體不能超過2/3，蓋緊蓋子后松動一圈，或用鋁箔紙包緊；

2.高壓滅菌開始時，先打開排氣口，待熱水蒸氣排出數(shù)分鐘后，關(guān)閉閥門滅菌，調(diào)溫，20分鐘。待壓力降到0后放氣；3.滅菌后，讓瓶子冷卻，并及時扭緊瓶蓋；4.可以將高壓蒸鍋蓋留一條縫，在加熱至100度，冷卻后高壓蒸鍋內(nèi)的器材也自動烘干了。5.一般器材開15-20分鐘即可，液體30分鐘。高壓滅菌

注意：

1．有時裝液體的瓶子可能破裂，可將瓶子放在鋼制托盤中，防止瓶子一旦破裂時，試劑流入高壓鍋內(nèi)。

2．高壓滅菌全過程中，應(yīng)有專人看護(hù)。

3．強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、揮發(fā)性液體、爆炸性物質(zhì)不能開蒸鍋。過濾除菌

用于熱不穩(wěn)定的、易揮發(fā)的或體積小于20ml的溶液。利用重力、加壓或真空的方法，使溶液通過孔徑足夠小的膜除去微生物。

0.2微米的濾膜—緩沖液和一般培養(yǎng)基

0.1微米的濾膜—組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基

七、緩沖液和溶液的儲存

培養(yǎng)液應(yīng)該在4℃儲存。緩沖液可以在4℃或者室溫儲存。濃度高的溶液室溫保存。光敏感試劑應(yīng)該在適宜的溫度下在棕色瓶中儲存，或放在盒子里的瓶內(nèi)保存，瓶外裹上鋁箔保存也可以。第八章

貯藏和處理

Logo緊急貯藏1儲存試劑2分裝3冰箱和冷庫4實驗室廢物的處理5

貯藏和處理緊急貯藏物品緊急貯藏方式酸或堿直接留在實驗臺上；單獨(dú)保存酸和堿單克隆和多克隆抗體多數(shù)純化過的抗體長期在4℃保存，但有一些需要-20℃保存分析管可以在4℃保存，但試驗的穩(wěn)定性不同（大多數(shù)比色反應(yīng)不能過夜測定）緩沖液4℃細(xì)胞返回原處或丟棄去垢劑室溫DNA4℃緊急貯藏物品緊急貯藏方式酶大多數(shù)限制性內(nèi)切酶保存在-20℃，但一定要先閱讀說明，有些酶不能冷凍乙醇室溫生長因子和細(xì)胞因子-20℃PCR反應(yīng)4℃RNA酒精中-20℃，水溶液-70℃脂類-20℃，大多數(shù)脂類不穩(wěn)定，對氧氣或光線敏感，或者隨溫度變化而改變培養(yǎng)基4℃緊急貯藏細(xì)胞平板或穿刺培養(yǎng)物4℃液體培養(yǎng)物4℃凍干培養(yǎng)物4℃冷凍培養(yǎng)物-70℃放射性同位素

32P核苷酸態(tài)的，-20℃；磷酸鹽的，4℃

33P4℃35S甲硫氨酸的硫，-70℃125I125I蛋白質(zhì)A，4℃；單質(zhì)125I通風(fēng)櫥室溫保存3H4℃14C4℃儲存試劑儲存試劑的須知儲存和丟棄須知的獲取怎樣保存需要干貯的試劑如何儲存光敏感試劑如何儲存氧敏感試劑儲存試劑的須知

溫度要求把試劑儲存在烘箱、室溫、冰箱、低溫冷柜或液氮中空氣要求注意試劑是否對氧氣敏感，或者需要其他氣體保存濕度要求如果水蒸氣對試劑有害，那么必須干貯或者真空保存相關(guān)的危害：注意試劑是否是放射性同位素、易燃、劇毒或揮發(fā)性的。試劑必須按照儲存要求存放。儲存和丟棄須知的獲取物質(zhì)安全資料表（MSDS）Merck手冊環(huán)境健康與安全部門部在因特網(wǎng)上搜索怎樣保存需要干貯的試劑容器容器必須能蓋緊，內(nèi)部有放干燥劑的空間。對于一些試劑，廣口瓶是最好的。對于更大的瓶子來說，玻璃或塑料的干燥器是必需的。干燥器有不同的形狀、大小和材料，應(yīng)該首先考慮大小。性質(zhì)活潑的試劑需要真空保存，任何用于厭氣培養(yǎng)細(xì)菌的容器也需要真空潤滑劑。干燥劑干燥劑通常是藍(lán)色或紫色粗糙的碳酸鈣小圓球，或是相類似的圓球。干燥劑一般裝在袋子、桶或是有孔的罐子里。干燥劑也可以用于氣體的干燥，但大多數(shù)實驗室并不采用。

干燥器

PC-3塑料真空干燥器玻璃干燥器如何儲存光敏感試劑

棕色瓶或琥珀色瓶儲存，或者用鋁箔包好。管裝試劑可以放在盒子中，可凍存或運(yùn)輸?shù)暮凶幼钸m合。將常規(guī)信息貼在盒子上，如“內(nèi)有光敏感試劑”，但是光敏感試劑應(yīng)是盒子中的唯一試劑，不要在盒子中到處尋找其他試劑。常見的光敏感試劑有放線菌素D、絲裂菌素C、氮藍(lán)四唑(NBT)、酚、利福霉素和四環(huán)素。如何儲存氧敏感試劑

氮?dú)馄勘仨毞旁诨瘜W(xué)通風(fēng)櫥的附近，因為通常有機(jī)溶劑的溶液需要氮?dú)?，使用時打開通風(fēng)櫥。確定氮?dú)馄坑脦ё庸潭ㄗ?。將巴氏管插入和壓力調(diào)節(jié)器相連的管子中。打開氮?dú)?，將流量調(diào)節(jié)到將管子靠近手背也幾乎感覺不到為止。在通風(fēng)櫥中打開試管或瓶子，試管和瓶子應(yīng)妥善的放置在架子上。將巴氏管的尖端放入容器口至能看到液體表面有波浪，保持5-10秒，較高的液體-氣體比例需更長的時間。迅速蓋上容器。關(guān)掉氮?dú)狻１４嫫孔?，通常保存?20℃，也可以保存在真空。分裝為什么要分裝什么時候不用分裝如何分裝為什么要分裝

防止儲存液反復(fù)凍融造成的降解避免多次使用造成的污染空間上方便節(jié)省時間什么時候不用分裝

稀釋的物質(zhì)不穩(wěn)定不常用的物質(zhì)使用不同濃度或濃度變化范圍較大的物質(zhì)如何分裝

①配制儲備液須知：物質(zhì)的工作濃度在什么溶劑中溶解物質(zhì)分裝的體積②決定配成幾倍。③準(zhǔn)備好無菌的管子，做好標(biāo)簽。如果要分裝的物質(zhì)必須冷藏，就把管子置于冰上。④配制濃溶液，如果需要，過濾。⑤把配好的無菌溶液分裝到試管,存放在冷藏庫或者是合適溫度的架子上。⑥在記錄本上做好記錄。冰箱和冷庫使用適當(dāng)?shù)谋浠蚶洳貛熘挥性谌≡噭┑臅r候才打開冰箱門冰箱或冷藏庫內(nèi)所有容器都必須有標(biāo)簽定期清理那些已經(jīng)不用的試劑把所有試劑放置的位置記錄下來尊重私人空間怎樣除霜除霜工作應(yīng)該提前一個星期做計劃除霜前的清理是丟棄無用試劑的好時機(jī)仔細(xì)地把所有試管包好除霜要在上午盡可能早的時候開始戴好手套除冰備好任何可以吸水的東西，還有放置丟棄吸水物的盆除霜用吹風(fēng)機(jī)加速除霜除去所有產(chǎn)生的水保持地面干燥把除過霜的冰箱擦干凈等到冰箱完全干了才能插上電源記錄試劑的放置位置

實驗室廢物的處理

實驗室廢物處理須知：化學(xué)組成有危害還是無危害是否有放射性是否有生物危害是否可以回收利用處理的優(yōu)先順序

放射性，固體；放射性，液體；化學(xué)危害廢物；生物危害廢物；尖利物品；無害的化學(xué)物品。第九章

無菌技術(shù)操作

Logo何時使用無菌技術(shù)1無菌技術(shù)2保護(hù)實驗人員3

無菌技術(shù)操作什么時候使用無菌技術(shù)當(dāng)必須進(jìn)行無菌操作時無論什么時候在進(jìn)行活的有機(jī)體實驗或是為進(jìn)行活體實驗二準(zhǔn)備培養(yǎng)基、緩沖液、培養(yǎng)容器等時，必須使用無菌操作技術(shù)，例如：準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化用的大腸桿菌培養(yǎng)物制備LB平板培養(yǎng)基分裝細(xì)胞過濾培養(yǎng)基的血清打開和溶解凍細(xì)胞什么時候使用無菌技術(shù)在無菌操作有幫助的情況下限制性酶切反應(yīng)：雖然大部分酶被保存在甘油中，而且甘油濃度大于50%時通常不會長菌，但是在稀釋酶和進(jìn)行沒有甘油參與的操作時存在潛在污染的可能性，而且微量的常見元素的污染也會抑制酶的活性。進(jìn)行PCR反應(yīng)：進(jìn)行PCR反應(yīng)時要防止外源性DNA等的污染，避免造成酶活性和特異性降低。利用32P磷酸鹽標(biāo)記細(xì)胞：使用無菌技術(shù)是出于對自身的保護(hù)，而不是出于保護(hù)細(xì)胞。出于無菌考慮，不應(yīng)讓蓋子一直敞開，不能讓氣霧產(chǎn)生以及不要使用已經(jīng)用過的移液管。無菌技術(shù)

規(guī)則工作區(qū)域盡可能地遠(yuǎn)離通風(fēng)口和交通口確保整潔的工作環(huán)境實驗前用消毒劑或清潔劑清潔工作區(qū)域所有用到的移液管和試劑瓶都必須是無菌的工作區(qū)間內(nèi)盡量減少手臂的運(yùn)動把所有可能用到的東西都準(zhǔn)備好戴好乳膠手套并及時更換技術(shù)技巧最小化保持試劑瓶與桌面成大約45°角時打開蓋子若必須取下蓋子，則要把它倒放在干凈的臺面上使用玻璃的移液管及打開試劑瓶時都要用火燒一下塑料的試劑瓶和移液管不能用火燒輕輕地吸取液體，不要旋轉(zhuǎn)試劑瓶不要讓試劑瓶保持開口狀態(tài)停下你手中的工作移液使用可重復(fù)使用的玻璃移液管使用一次性移液管過濾除菌用注射式過濾器過濾少量溶液使用杯狀濾器過濾大體積的溶液抽氣操作保護(hù)實驗人員生物安全水平的要求生物安全櫥生物安全櫥是為操作原代培養(yǎng)物、菌毒株以及診斷性標(biāo)本等具有感染性的實驗材料時，用來保護(hù)操作者本人、實驗室環(huán)境以及實驗材料，使其避免暴露于上述操作過程中可能產(chǎn)生的感染性氣溶膠和濺出物而設(shè)計的。更側(cè)重于保護(hù)操作人員和環(huán)境，防止操