血小板功能檢測

血小板功能檢測：血小板在止血和動脈血栓形成中的作用包含粘附到受損血管處或破碎的動脈粥樣硬化斑塊處，形成止血栓或凝塊；加快凝血瀑布致使凝血酶的形成。本文綜述了血小板的作用，列舉了遺傳性的血小板缺點及異樣出血性疾病，并議論了各樣血小板致聚劑。本文綜述了各樣血小板功能檢測方法以及它們的優(yōu)弊端：出血時間測定；利用透光性的改變來檢測枸櫞酸鈉抗凝的富含血小板血漿中血小板的齊集功能；阻抗齊集儀檢測枸櫞酸鈉抗凝全血中血小板的齊集功能；高切變力血小板功能剖析儀（PFA-100）和Ultegra快速血小板功能測定儀檢測血小板有關(guān)的止血功能；用錐板剖析儀檢測高切變力下血小板的粘附和齊集功能；檢測血小板顆粒內(nèi)容物的分泌（ATP,14C-5-羥色胺,血小板第4因子和β－血小板球蛋白）和血栓烷B2的形成；流式細胞術(shù)檢測體內(nèi)和體外使用致聚劑的血小板激活狀況（包含血小板膜糖蛋白構(gòu)象改變，P-選擇素和磷脂酰絲氨酸的表達）；檢測遺傳性缺點中血小板膜糖蛋白的水平。簡介血小板在止血和血栓中的作用當血管損害時，血小板會快速粘附到損害處，齊集形成由纖維蛋白固定的止血塊。在微血管損害處及破碎的動脈粥樣硬化斑塊處也會發(fā)生近似的過程，最后形成血小板－纖維蛋白血栓，引起動脈硬化癥的血栓性并發(fā)癥。體內(nèi)能夠激活血小板的引誘劑主要有膠原蛋白，ADP，血栓烷A2（TXA2），凝血酶，弱引誘劑有5－羥色胺和腎上腺素。血小板上不單有針對這些介質(zhì)的受體，還有纖維蛋白原和VWF的受體。TXA2的形成和開釋以及血小板致密顆粒中分泌的ADP和5－羥色胺會加快血小板的激活過程，促凝表面的裸露促進凝血酶的形成，而凝血酶是強有效的激活劑。激活也會引誘α-顆粒內(nèi)容物的分泌和顆?？缒さ鞍譖-選擇素出此刻血小板的表面上。全部血小板致聚劑都擁有共同作用，所以當凝聚過程的某個門路存在缺點或被克制時，血小板的凝聚功能將被大大受損。在血管壁的損害處，血小板與內(nèi)皮下細胞外基質(zhì)中的VonWillebrand因子（VWF），膠原蛋白和纖維聯(lián)合素粘附在一同。在高切變力狀況下，血小板糖蛋白GPIb/IX/V復合物與VWF的互相反響是特別短暫的，但當VWF與血小板表面的GPIIb/IIIa聯(lián)合，這一過程會變?yōu)椴恍心娴?。血小板表面膠原蛋白受體包含GPIa/IIa（α2β1），它在粘附過程中擁有特別重要的作用；而GPVI在血小板活化惹起TXA2的形成和開釋以及致密顆粒和α儲存顆粒內(nèi)容物的分泌過程中起作用。血小板存在TXA2和ADP受體，在損害處流動的血小板受刺激后會改變形狀，伸出偽足，從而在粘附血小板四周形成齊集物。齊集過程需要血小板表面的異二聚體整合素分泌和血小板表面磷脂雙分子層翻轉(zhuǎn)裸露促凝磷脂表面，往常為磷脂酰絲氨酸（PS）翻轉(zhuǎn)到血小板表面。也會產(chǎn)生促凝活性的微粒。PS的裸露大大加快了凝血門路因子Ⅹ和凝血酶原酶的反響，產(chǎn)生了最有效的血小板引誘劑--凝血酶。凝血酶切開血小板表面的蛋白酶激活受體，致使GPIIbGPIIb/IIIa復合物轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白原的受體或某些狀況下作為VWF的受體。這些蛋白會在周邊的受刺激的血小板之間搭橋。激活的正常的GPIIb/IIIa在血小板齊集過程中特別重要。當血小板受膠原蛋白和凝血酶等致聚劑刺激，能惹起血小板顆粒的/IIIa的激活，形成TXA2和惹起血小板顆粒內(nèi)容物的分泌。凝血酶相同促進纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，包裹在血小板聚合物表面形成牢固的止血塊或血栓。在磷脂酶A2作用下膜磷脂釋要目的在于確立異樣出血的原由或保證在手術(shù)或牙科侵入性操作（包含拔牙）過程中的正常止血功能。多種方法試試來證明高血小板活性有血栓形成的偏向，這個專題近來被Thiagarajan和Wu等進行綜述。異樣出血常有的原由為血小板減少癥，這可經(jīng)過血小板計數(shù)來確立。當血小板計數(shù)低放出花生四烯酸時可產(chǎn)生TXA2。在環(huán)氧化酶（COX-1）和血栓烷合酶作用下，花生四烯酸轉(zhuǎn)變?yōu)門XA2。TXA2只好短期存在，很快形成無活性的穩(wěn)固產(chǎn)物TXB2。COX－1被阿司匹林不行逆地滅活，所以血小板生成TXA2的能力遇到它們在外周循環(huán)逗留時間的影響。任何一項血小板功能受損，都會削弱凝血功能。血小板功能檢測的主于50-70×109/l，就會致使瘀斑和凝血異樣。血小板減少癥會影響大部分血小板功能檢測方法，但對流式細胞術(shù)除外。遺傳性和獲取性血小板功能缺點表1列舉了部分遺傳性疾病，它們的血小板功能存在某種程度的受損，有顯然的出血癥狀。除VonWillebrand病(VWD)外，大部分缺點特別稀有。固然某些食品和天然物質(zhì)中含有克制物，可是藥物要素還是最主要的惹起獲取性血小板功能低下的原由。克制血小板功能的藥物中有能抑制COX的阿斯匹林和其余非甾醇類抗感染藥，抗生素如青霉素，thienopyridines（噻氯匹定和clopidogrel），GPIIb/IIIa拮抗劑，影響cAMP水平的藥物，抗凝劑如肝素，纖溶制劑，心血管藥物，神經(jīng)科藥物和麻醉藥物等。到當前為止阿司匹林是最常有的克制劑，至罕有250種藥物中含有這類成分。阿司匹林的作用是長久的，它對COX-1的乙?；饔檬遣恍心娴摹７茄合到y(tǒng)疾病惹起血小板功能降低的疾病有：尿毒癥，慢性肝病，骨髓增殖性疾病和獲取性VWD。表1遺傳性出血疾病Glanzmann血小板機能不全：GPIIb/IIIa（αIIbβ3）缺失或異樣它是纖維蛋白原和VWF的受體，對任何血小板致聚劑無反響。Bernard-Soulier巨大血小板綜合癥：GPIb/IX/V缺失或異樣它參加血小板與內(nèi)皮下的VWF粘附。對瑞斯霉素無反響。GPIa/IIa（α2β1）缺失或異樣。不可以粘附膠原蛋白GPVI缺失或異樣。不可以被膠原蛋白激活P2Y12缺失或異樣。它是ADP和腺苷酰環(huán)化酶的受體。特別稀有儲存池疾病包含血小板分泌缺點初級分泌缺點。是因為顆粒內(nèi)容物缺點或放大門路缺點以外的原由惹起的一大類分泌性疾病—最常有的先本性分泌缺點病致密顆粒缺點（δ－顆粒）（如Hermansky-Pudlack綜合癥，Chediak-Higashi綜合癥）α－顆粒缺點（α－顆粒）（灰血小板綜合癥）致密顆粒和α－顆粒缺點Quebec血小板綜合癥Jacobsen或Paris-Trousseau綜合癥Scott綜合癥。刺激后不形成促凝表面花生四烯酸動員，環(huán)氧化酶，血栓烷酶或TXA2受體、VWF缺點1型VWD-VWF部分減少（占80％病例）2型VWD－VWF異樣（占15-20％病例）3型VWD－VWF缺失（稀有）血小板型VWD。GPIb/IX/V表型功能加強纖維蛋白原缺乏癥血小板功能檢測最早的檢測血小板功能的方法是出血時間。Thiagarajan和Wu定義的皮膚表面出血時間為：在上臂處用血壓繃帶加壓到40mmHg，而后采用一次性的自動的設(shè)施在前臂的掌側(cè)皮膚表面上劃一道長10mm，深1mm標準的切口，每隔30秒吸去傷口處的血液，直到出血停止。正常的出血時間少于10分鐘。當血小板計數(shù)小于100×109/l時，出血時間會延伸，所以這一方法“在血小板減少的患者測定血小板功能的缺點時作用有限”。它的長處在于操作簡單，快速，不需要對血液進一步的檢測和辦理，弊端是受技術(shù)人員的操作技術(shù)，皮膚厚度和溫度的影響。本方法缺乏一致性，在判斷出血偏向方面是不敏感指標。其余血小板功能檢測方法需要當心抽血和辦理?；颊卟豢梢约涌噹Ш鸵恢懿豢梢苑糜绊懷“骞δ艿乃幬?。19-20號針頭和塑料注射器用于靜脈穿刺，從靜脈穿刺到實驗的間隔時間必要標準化，這是因為血樣中丟掉的CO2會使pH值高升，增添血小板對致聚劑的反響能力。必須防備溶血，因為溶解的紅細胞會開釋出血小板的引誘劑ADP。容器一定是塑料的或硅化玻璃以防備血小板吸附到容器表面?？鼓齽┑倪x擇以及溫度也會影響血小板的功能，抗凝血應(yīng)置于室溫或37℃，而不可以置于4℃。一般不介紹使用真空管，除非使用自動血小板功能剖析儀（見和）。最常有的抗凝劑是枸櫞酸鈉，它能夠?qū)⑩}離子的濃度降到微摩爾級（枸櫞酸鈉終濃度為，鈣離子的濃度為40μM；枸櫞酸鈉終濃度為，鈣離子的濃度＜5μM）。假如使用EDTA抗凝劑，鈣離子的濃度將能低至不可以使血小板凝聚。肝素的成效不好，因為血小板常常粘附到試管壁，并且會使血小板集聚，在離心中堆積到紅細胞中，使富含血小板血漿中的血小板數(shù)量減少。水蛭素和PPACK經(jīng)過克制凝血酶的活性來抗凝，它們能夠保持生理性濃度的鈣離子，而某些實驗中正需要這類濃度，但水蛭素的價錢特別昂貴沒法慣例使用。血小板齊集到當前為止評論血小板功能最常有的方法是測定血小板的齊集功能，抗凝血在離心力135g離心15分鐘，制備富含血小板血漿（PRP）。假如可能，血小板計數(shù)應(yīng)該標準化（如在濃度為250×109/l時測定）,這能夠經(jīng)過加入少血小板血漿來實現(xiàn)。1毫升（或毫升）PRP在37℃加入到裝有金屬磁棒的玻璃試管中，在齊集儀中磁棒以1100rpm轉(zhuǎn)動，經(jīng)過比色計記錄穿過PRP的光強度。大部分引誘劑加入后，血小板形態(tài)由片狀轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形，形成偽足，惹起短暫的光透過率的降落，而后因為血小板齊集，光透過率大幅度增添。光透過率增添的速度和程度會被記錄下來。致聚劑主要為ADP，腎上腺素，膠原蛋白，花生四烯酸，TTXA2的近似物如U46619，或凝血酶受體活化肽如SFLLRN。（凝血酶不可以作為PRP的促凝劑，因為會惹起凝固）。正常狀況下枸櫞酸抗凝的PRP，對高濃度致聚劑反響的齊集程度，與TXA2的形成，顆粒內(nèi)容物的分泌和血小板表面P-選擇素的形成有關(guān)。低血小板計數(shù)會影響血小板齊集試驗，假如PRP中血小板計數(shù)低于100×109/l結(jié)果就不行靠。假如是脂血，也不可以進行此試驗。假如血小板改變了形態(tài)，但不可以與全部的致聚劑發(fā)生齊集，則其原由可能是稀有的Glanzmann血小板減少癥。與膠原蛋白或凝血酶對比，ADP是弱的致聚劑，在枸櫞酸抗凝的PRP中，低濃度ADP只引開初步的，不完整的，可逆的齊集。但當濃度高于1-3μM時，初級的血小板齊集將不行逆，并且緊接著會惹起第二相不行逆的過程（圖1）。這個兩相血小板齊集過程依靠TXA2的形成。高濃度ADP狀況下，這兩相齊集過程會交融，形成一個光滑的曲線（圖1），近似于膠原蛋白或凝血酶的刺激成效。藥物，如阿司匹林，會克制TXA2的形成，阻擋了ADP介導的第二相齊集過程。在生理性的鈣離子介質(zhì)中，只會發(fā)生第一相的齊集反響。ADP引誘齊集嚴重減弱，以及膠原蛋白和凝血酶引誘齊集受損，提示為稀有的P2Y12ADP受體異樣。噻氯匹定和clopidogrel經(jīng)過此受體作用，產(chǎn)生近似的對ADP引誘選擇性克制。弱的致聚劑，腎上腺素（5-10uM），可齊集PRP中的血小板，而不改變血小板的形態(tài)，但腎上腺素的致聚作用其實不一致。假如服用了阿司匹林或其余克制TXA2形成的藥物，血小板對任何濃度的腎上腺素都不反響，不會產(chǎn)生齊集。膠原纖維（1-5μg/ml）會惹起特點性滯后（可達1分鐘）的血小板齊集,齊集需要TXA2形成和顆粒內(nèi)容物的分泌，并且基本上是不行逆的。固然血小板形態(tài)發(fā)生了變化，可是阿司匹林及其余克制TXA2形成的藥物能夠阻斷低濃度的膠原蛋白惹起的齊集反響。稀有的GPVI缺點癥表現(xiàn)為血小板受膠原蛋白刺激后其實不發(fā)生齊集，但在遇到其余致聚劑的刺激后往常會發(fā)生齊集?；ㄉ南┧崮軌蜣D(zhuǎn)變?yōu)門XA2，所以可作為齊集劑。阿司匹林和其余能夠克制環(huán)氧化酶的藥物擁有克制作用?？墒荰XA2的近似物U46619，卻能夠在此類克制劑的存在狀況下產(chǎn)生齊集作用。在稀有的環(huán)氧化酶缺失的病人，花生四烯酸不引誘血小板齊集，但U46619會惹起血小板的齊集。SFLLRN(TRAP)擁有凝血酶的引誘血小板強齊集作用的功能，只有當TXA2形成阻礙時，這一作用才會稍有減弱。分泌缺點，特別是致密顆粒缺乏ADP的加強作用，會造成異樣的齊集，即存在正常的第一相過程，而無第二相過程。分泌缺點時低濃度的膠原蛋白和SFLLRN引誘血小板齊集合減弱。瑞托霉素齊集血小板這一試驗相同用齊集儀對枸櫞酸抗凝的PRP進行測試?？股厝鹜忻顾乜勺鳛橹戮蹌?，終濃度常有為ml。正常的樣本是第一相齊集后緊接著會發(fā)生第二相齊集。缺乏反響提示為Bernard-Soulier綜合癥或VWF缺乏。全血血小板齊集用阻抗血小板齊集儀可測定稀釋的抗凝全血的血小板齊集功能。將兩個電極插入樣本中，當有電流經(jīng)過時，血小板會粘附到電極上。而后增添致聚劑加以攪拌，在電極上的血小板四周血小板齊集，記錄阻抗變化的速率和幅度。這一試驗的長處在于不用制備PRP，并且脂血中的血小板功能也可丈量，但不適合血小板計數(shù)極低的病人。血小板功能剖析儀－100DadeBehring血小板功能剖析儀（PFA－100）是微辦理器控制的儀器，它可定量測定高切變力下血小板和血小板有關(guān)的止血功能。試驗過程為枸櫞酸抗凝血加到裝有一次性試驗管的槽內(nèi)（要求4小時內(nèi)血樣），預溫到37℃，而后利用真空吸力使血樣經(jīng)過一個直徑200μm的不銹鋼毛細管和直徑為150μm的硝酸纖維膜微孔，膜上包被膠原蛋白和腎上腺素（CEPI）或膠原蛋白和ADP（CADP）。在5000-6000/s的高切變和引誘劑的作用下，血小板產(chǎn)生齊集，阻擋血液穿過微孔，擁塞微孔的時間稱為停止時間（CT），最大測定值為300秒。血小板最先經(jīng)過GPIb/IX/V和VWF間的互相作用以及GPIa/IIa,VWF的直接連結(jié)粘附到膜上的膠原蛋白上致使齊集，而不是由纖維蛋白原連結(jié)到活化血小板的GPIIb/IIIa惹起齊集。的枸櫞酸鈉抗凝時獲取的CT值比濃度為枸櫞酸鈉抗凝CT值要大，所以選擇適合的抗凝劑濃度是特別重要的。PPACK也可用作抗凝劑。僅在CEPI管CT時間延伸，可能是稍微的遺傳性血小板功能缺點（如儲存池異樣）和阿司匹林克制。CEPI管和CADP管CT時間均延伸，可能為嚴重的遺傳性血小板功能阻礙（如Glanzmann血小板機能不全和Bernard-Soulier綜合癥）和VWD。實質(zhì)上PFA-100是有效的挑選VWD的手段，特別是1型－VWD，并且對婦女月經(jīng)過多及少兒的鼻出血思疑有血小板異樣或VWD進行鑒識是特別實用的。它同時有益于監(jiān)測1型－VWD患者對DDAVP的反響和PTCA患者對GPIIb/IIIa拮抗劑的反響，也可用于評估血庫供給的濃縮血小板質(zhì)量和血小板輸注的效果。PFA-100擁有操作簡單，快速，重復性好，全血用量少的長處。血小板計數(shù)少于50×109/L和紅細胞比容＜25％時會惹起CT時間延伸。Ultegra快速血小板功能檢測Accumetrics快速血小板功能實驗（RPFA）供給了一種簡單，快速，正確的血小板功能檢測方法，它用于床邊監(jiān)測接受GPIIb/IIIa拮抗劑的患者。枸櫞酸鈉抗凝全血收集后，立刻取樣本加到有2個樣本通道的一次性試管中。經(jīng)過由微辦理器驅(qū)動的鋼珠運動，血液與血小板致聚劑（iso-S）FLLRN和纖維蛋白原包被的聚苯乙烯珠混勻70秒，檢測樣本的透光強度。激活的血小板和包被纖維蛋白原的珠子之間發(fā)生凝聚，沉入底部，惹起光透過率的增添。凝聚的速度和強度可用血小板凝聚單位（PAU）計算，當有GPIIb/IIIa拮抗劑存在，PAU值會快速降落，這是因為凝聚發(fā)生與活化血小板上的未被阻斷的GPIIb/IIIa受體成正比關(guān)系。RPFA用來監(jiān)測GPIIb/IIIa拮抗劑abciximab,tirofiban,eptifibatide和orofiban對血小板的阻斷成效。錐板剖析儀Varon及其同事開發(fā)了錐板剖析儀（CPA），在高切變力的條件下使用錐板粘度計檢測血小板的粘附和齊集。這一裝置經(jīng)過錐體的旋轉(zhuǎn)在板表面產(chǎn)生均一的切變壓力惹起層流。的枸櫞酸鈉抗凝全血加到聚苯乙烯板上，以1800/s切變速度旋轉(zhuǎn)2分鐘，隨后染色。圖形剖析儀分析粘附的血小板和血小板齊集，可供給大小散布的的直方圖，表面覆蓋的百分比(SC)和均勻大小(AS)。血小板粘附到聚苯乙烯板上依靠于板上包被的VWF和纖維蛋白原，GPIIb/IIIa，GPIb/IX/V以及血小板的激活。CPA可快速確立先本性和獲取性的血小板缺點及VWD，也可測試抗血小板療效和確立血小板功能亢進患者的血栓前形成狀態(tài)。CPA的長處在于快速，簡單，只要全血。顆粒內(nèi)容物分泌的檢測發(fā)光齊集儀可同時檢測血小板齊集和ATP（一種致密顆粒的構(gòu)成部分）的開釋。用熒光素酶檢測ATP，ATP的濃度參照正常人PRP和已知ATP濃度制備的標準曲線進行計算。加入引誘劑，檢測已標志血小板的14C-5-羥色胺的分泌狀況可指示致密顆粒的分泌狀況。當引誘分泌內(nèi)容物時，α顆?？缒さ鞍譖-選擇素會出此刻血小板的表面，這可經(jīng)過流式細胞儀檢測（見）。血小板第4因子（PF4）和β－血小板球蛋白是血小板特異性蛋白，儲存于α顆粒，在血小板激活時開釋。可用放射性免疫方法測定，但應(yīng)注意靜脈穿刺對結(jié)果影響比較大?；ㄉ南┧岬膭訂T和血栓烷B2的形成在正常狀況下，引誘劑可將花生四烯酸從血小板的磷脂層中動員出來，并經(jīng)過血小板轉(zhuǎn)變?yōu)檠ㄍ锽2。血栓烷B2是一種穩(wěn)固的復合物，可經(jīng)過商用的放射性免疫測定法和酶免法來測定。流式細胞術(shù)流式細胞術(shù)可快速檢測抗凝血、稀釋全血、PRP、人工介質(zhì)中懸浮的少許血小板。使用全血能夠防止操作過程中血小板被激活。往常血小板與聯(lián)接不一樣光譜的熒光素的兩種單克隆抗體（MoAbs）反響。為確立血小板的特異性，第一個MoAb特異性針對GPIb,IIb或IIIa，并在近飽和溶液中使用。為確立血小板上的抗原決定簇，血小板還與另一標志MoAb反響。這類MoAb特異性針對表位，也在飽和溶液中使用。與抗體孵育后，稀釋樣本以1000-100，000細胞/min的速度在流式細胞儀上檢測。聚焦激光束在其相應(yīng)的汲取光譜內(nèi)激發(fā)了聯(lián)接的熒光。血小板經(jīng)過表記的熒光素以及前向角和側(cè)向角的特征進行確認。第二個單抗發(fā)出的熒光強弱與某一抗原決定簇的密度成正比，并可經(jīng)過獲取上千個血小板來計數(shù)。這些數(shù)據(jù)均可用軟件來剖析。因為激發(fā)光譜有部分被重疊，每一混淆熒光需設(shè)置賠償。假如抗原決定簇的表達跟著時間而變化（如膜GPs的滑動），著色前血小板可先用1％的多聚甲醛固定，它不擾亂抗體聯(lián)合。假如不是立刻進行流式細胞儀檢測，血小板也可在加入著色劑后再固定（原理同上）。很多熒光素標志的抗體及非抗體源的探針均可標志血小板抗原決定簇。MoAbs除能夠和未被活化血小板的GPs聯(lián)合外，某些激活依靠MoAbs可檢測GPs構(gòu)象變化（如PAC1可檢測GPIIb/IIIa）或顆粒膜蛋白表達（如抗P－選擇素）。非抗體探針包含PKH親脂性膜染料，可用鏈親和素標志熒光檢測的生物素和用于檢測血小板活化促凝表面的裸露狀況的熒光標志的an