青霉素發(fā)酵操作手冊B5

青霉素生產(chǎn)仿真使用手冊北京東方仿真軟件技術(shù)有限公司

2008年8月2 2 4 4 5 5 6 67>????????I77 8 8 9 10 11 11 13 13 14 14 14 15 17 17曰錄I—IV、................................第一章背景知識 1.1青霉素的發(fā)現(xiàn) 1.2青霉素分類及分子結(jié)構(gòu).……1.3青霉素的單位 1.4作用機(jī)理 1.5青霉素的應(yīng)用 第二章發(fā)酵工藝過程 2.1菌種介紹 2.2菌種的保藏 2.3孢子的制備 2.4種子制備 2.5發(fā)酵培養(yǎng)基介紹. 2.6滅菌 2.7發(fā)酵 2.7.1發(fā)酵的過程控制 2.7.2防止染菌的要點(diǎn) 2.7.3空氣系統(tǒng)的要求 2.7.4蒸汽系統(tǒng)的要求 第三章提煉工藝過程 3.1發(fā)酵液預(yù)處理 3.2提取 3.3精制 3.3.1脫色和去熱原質(zhì) 17 17 18 19 19 19 19 20 20 20 21 21 21 21 21 21 22 22 23 2426?????? 26 27 27 27 283.3.2結(jié)晶 3.4成品鑒定 3.5成品分裝 第四章操作規(guī)程 4.1發(fā)酵工藝過程 4?1?1正常發(fā)酵（過程） 4.1.2出料 4.1.3發(fā)酵過程中PH值低 4.1.4發(fā)酵過程中？日值高 4.1.5發(fā)酵過程中溶解氧低 4?1?6殘?zhí)菨舛鹊?4.17發(fā)酵過程中溫度高 4.1.8泡沫高 4.2提煉工藝過程 4.2?1預(yù)處理操作 4.22一次BA萃取操作 4.23一次反萃取操作 4.24二次BA萃取操作 4.25脫色罐操作 4.26結(jié)晶罐及抽濾、干燥操作 24第五章主要操作畫面 5.1青霉素工藝流程界面......5.2菌種介紹界面 5.3孢子制備界面 5.4種子制備界面 5.5滅菌界面

28 29 29 30 28 29 29 30 30 31 31 32 32 33 33 34 34 355.7發(fā)酵工藝操作界面 5.8發(fā)酵罐操作界面 5.9菌種曲線界面 5.10預(yù)處理界面 5.11提取流程總貌 5.12~次BA萃取界面 5.13精制流程總貌 5.14脫色操作界面 5.15結(jié)晶操作界面 5.16抽濾、干燥操作界面……5.17成品鑒定界面 5.18成品分裝界面 第六章主要工藝指標(biāo) 第七章主要設(shè)備列表及仿真操作設(shè)備 37第八章思考題 39第一章背景知識1.1青霉素的發(fā)現(xiàn)1928年，英國細(xì)菌學(xué)家Fleming發(fā)現(xiàn)污染在培養(yǎng)葡萄球菌的雙蝶上的一株霉菌能殺死周圍的葡萄球菌。他將此霉菌分離純化后得到的菌株經(jīng)鑒定為點(diǎn)青霉，并將這菌所產(chǎn)生的抗生物質(zhì)命名為青霉素。1940年，英國Florey和Chain進(jìn)一步研究此菌，并從培養(yǎng)液中制出了干燥的青霉素制品。經(jīng)實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)證明，它毒性很小，并對一些革蘭氏陽性菌所引起的許多疾病有卓越的療效。1.2青霉素分類及分子結(jié)構(gòu)青霉素是6一氨基青霉烷酸（6-aminopenicillanicacid,6-APA）苯乙酰衍生物。側(cè)鏈基團(tuán)不同，形成不同的青霉素，主要是青霉素G。工業(yè)上應(yīng)用的有鈉、鉀、普魯卡因、二芐基乙二胺鹽。青霉素發(fā)酵液中含有5種以上天然青霉素（如青霉素F、G、X、K、F和V等），它們的差別僅在于側(cè)鏈R基團(tuán)的結(jié)構(gòu)不同，其中青霉素G在醫(yī)療中用得最多，它的鈉或鉀鹽為治療革蘭氏陽性菌的首選藥物，對革蘭氏陰性菌也有強(qiáng)大的抑制作用。青霉素的結(jié)構(gòu)通式可表示為1.3青霉素的單位目前國際上青霉素活性單位表示方法有兩種：一是指定單位（unit）；二是活性質(zhì)量（“g），最早為青霉素規(guī)定的指定單位是：50mL肉湯培養(yǎng)基中恰能抑制標(biāo)準(zhǔn)金葡萄菌生長的青霉素量為一個青霉素單位。在以后，證明了一個青霉素單位相當(dāng)于0.6“g青霉素鈉。因此青霉素的質(zhì)量單位為：0.6“g青霉素鈉等于1個青霉素單位。由此，1mg青霉素鈉等于1670個青霉素單位（unit）。1.4作用機(jī)理已有的研究認(rèn)為，青霉素的抗菌作用與抑制細(xì)胞壁的合成有關(guān)。細(xì)菌的細(xì)胞壁是一層堅韌的厚膜，用以抵抗外界的壓力，維持細(xì)胞的形狀。細(xì)胞壁的里面是細(xì)胞膜，膜內(nèi)裹著細(xì)胞質(zhì)。細(xì)菌的細(xì)胞壁主要由多糖組成，也含有蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁的組成是肽聚糖占細(xì)胞壁干重的50%?80%（革蘭氏陰性菌為1%?10%）、磷壁酸質(zhì)、脂蛋白、多糖和蛋白質(zhì)。其中肽聚糖是一種含有乙?；咸烟前泛投屉膯卧木W(wǎng)狀生物大分子，在它的生物合成中需要一種關(guān)鍵的酶即轉(zhuǎn)肽酶。青霉素作用的部位就是這個轉(zhuǎn)肽酶?，F(xiàn)已證明青霉素內(nèi)酞胺環(huán)上的高反應(yīng)性肽鍵受到轉(zhuǎn)肽酶活性部位上絲氨酸殘基的羥基的親核進(jìn)攻形成了共價鍵，生成青霉噻唑?；?酶復(fù)合物，從而不可逆的抑制了該酶的催化活性。通過抑制轉(zhuǎn)肽酶，青霉素使細(xì)胞壁的合成受到抑制，細(xì)菌的抗?jié)B透壓能力降低，引起菌體變形，破裂而死亡。1.5青霉素的應(yīng)用臨床應(yīng)用：40多年，主要控制敏感金黃色葡糖球菌、鏈球菌、肺炎雙球菌、淋球菌、腦膜炎雙球菌、螺旋體等引起感染，對大多數(shù)革蘭氏陽性菌（如金黃色葡萄球菌）和某些革蘭氏陰性細(xì)菌及螺旋體有抗菌作用。優(yōu)點(diǎn)：毒性小，但由于難以分離除去青霉噻唑酸蛋白（微量可能引起過敏反應(yīng)），需要皮試。各種半合成抗生素的原料：青霉素的缺點(diǎn)是對酸不穩(wěn)定，不能口服，排泄快，對陰性菌無效。氨芐青霉素耐酸廣譜；對抗綠膿桿菌的磺芐青霉素，耐酸、耐酶、口服的乙氧萘青霉素等。提供頭孢菌素母核。第二章 發(fā)酵工藝過程2.1菌種介紹青霉是產(chǎn)生青霉素的重要菌種。廣泛分布于空氣、土壤和各種物上，常生長在腐爛的柑桔皮上呈青綠色。目前已發(fā)現(xiàn)幾百種，其中產(chǎn)黃青霉(Penicillumchrysogenum)、點(diǎn)青霉(Penicillumnototum)等都能大量產(chǎn)生青霉素。青霉素的發(fā)現(xiàn)和大規(guī)模地生產(chǎn)、應(yīng)用，不僅對抗生素工業(yè)的發(fā)展起了巨大的推動作用，而且加上其他抗生素的廣泛使用，比如像磺胺藥物，使人類的平均壽命，再次延長了四歲。此外，有的青霉菌還用于生產(chǎn)灰黃霉素及磷酸二酯酶、纖維素酶等酶制劑和有機(jī)酸。1981年報導(dǎo)，癘孢青霉是纖維素酶的新來源，它能分解棉花纖維。2.2菌種的保藏菌種的保藏方法有：斜面菌種低溫保藏法、砂土管保藏法、甘油封藏法、真空冷凍干燥法。斜面菌種低溫保藏法利用低溫對微生物生命活動有抑制作用的原理進(jìn)行保藏。把斜面菌種、固體穿刺培養(yǎng)物或菌懸液等，直接放入4?5°C冰箱中。保藏時間一般不超過3個月，到時必須進(jìn)行移接傳代，再放回冰箱。砂土管保藏法 將干燥砂粒與細(xì)土混合后滅菌制成砂土管，然后接種保藏。若把砂土管放在低溫或抽氣后密封，效果更佳。此法適用于產(chǎn)孢子及芽孢菌種的保藏。保藏期1?10年。甘油封藏法向培養(yǎng)好的菌種斜面上，加入滅菌甘油，高出斜面1cm，然后蠟封管口，放入冰箱。該法既可防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，又能使菌種與空氣隔絕。保藏期1?2年。真空冷凍干燥法是目前比較理想的一種方法。在低于-15°C下，快速將細(xì)胞凍結(jié)，并保持細(xì)胞完整，然后在真空中使水分升華致干。在此環(huán)境中，微生物的生長和代謝都暫時停止，不易發(fā)生變異，故可長時間保存，一般為5?10年，最多可達(dá)15年之久。此法兼?zhèn)淞说蜏亍⒏稍锛叭毖鯉追矫鏃l件，使微生物可以保存較長時間，但過程較麻煩，需要一定的設(shè)備。2.3弛子的制備這是發(fā)酵工序的開端，是一個重要環(huán)節(jié)?？股禺a(chǎn)量和成品質(zhì)量同菌種性能以及同孢子和種子的情況有密切關(guān)系。生產(chǎn)用的孢子需經(jīng)過純種和生產(chǎn)能力的檢驗(yàn)，符合規(guī)定的才能用來制備種子。保藏在砂土管或冷凍干燥管仲的菌種經(jīng)無菌手續(xù)接入適合于孢子發(fā)芽或菌絲生長的斜面培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)成熟后挑選菌落正常的孢子可再一次接入試管斜面。對于產(chǎn)孢子能力強(qiáng)的及孢子發(fā)芽、生長繁殖快的菌種可以采用固體培養(yǎng)基孢子，孢子可直接作為中子罐的種子。2.4種子制備種子制備是指孢子接入種子罐后，在罐中繁殖成大量菌絲的過程，其目的是使孢子發(fā)芽、繁殖和獲得足夠數(shù)量的菌絲，以便接種到發(fā)酵罐當(dāng)中去。種子制備所使用的培養(yǎng)基及其它工藝條件，都要有利于孢子發(fā)芽和菌絲繁殖。種子罐級數(shù)是在指制備種子需逐級擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)，一般根據(jù)種子的生長特性、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度，以及發(fā)酵罐的容積而定。青霉素種子制備一般為二級種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)。2.5發(fā)酵培養(yǎng)基介紹培養(yǎng)基是供微生物生長繁殖和合成各種代謝產(chǎn)物所需要的按一定比例配制的多種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。培養(yǎng)基的組成和比例是否恰當(dāng)，直接影響微生物的生長、生產(chǎn)和工藝選擇、產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量等。青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基由碳源、氮源、無機(jī)鹽及金屬離子、添加前體、消沫劑五部分組成。碳源的主要作用是：為微生物菌種的生長繁殖提供能源和合成菌體所必需的碳成分；為合成目的產(chǎn)物提供所需的碳成分。青霉素發(fā)酵中常用乳酸或葡萄糖，也可采用葡萄糖母液、糖蜜等。其中乳糖最為便宜，但因貨源較少，很多國家采用葡萄糖代替。但當(dāng)葡萄糖濃度超過一定限度時，會過分加速菌體的呼吸，以至培養(yǎng)基中的溶解氧不能滿足需要，使一些中間代謝物不能完全氧化而積累在菌體或培養(yǎng)基中，導(dǎo)致pH下降，影響某些酶的活性，從而抑制微生物的生長河產(chǎn)物的合成。氮源的作用是供應(yīng)菌體合成氨基酸和三肽的原料，以進(jìn)一步合成青霉素。主要有機(jī)氮源為玉米漿、棉籽餅粉、花生餅粉、酵母粉、蛋白胨等。玉米漿為較理想的氮源，含固體量少，有利于通氣及氧的傳遞，因而利用率較高。固體有機(jī)氮源原料一般需粉碎至200日以下的細(xì)度。有機(jī)氮源還可以提供一部分有機(jī)磷，供菌體生長。無機(jī)氮如硝酸鹽、尿素、硫酸銨等可適量使用。碳酸鈣用來中和發(fā)酵過程中產(chǎn)生的雜酸，并控制發(fā)酵液的pH值，為菌體提供營養(yǎng)的無機(jī)磷源一般采用磷酸二氫鉀。另外加入硫代硫酸鈉或硫酸鈉以提供青霉素分子中所需的硫。由于現(xiàn)在還有一些工廠采用鐵罐發(fā)酵，在發(fā)酵過程中鐵離子便逐漸進(jìn)入發(fā)酵液。發(fā)酵時間愈長，則鐵離子愈多。鐵離子在50Mg/ml以上便會影響青霉素的合成。采用鐵絡(luò)合劑以抑制鐵離子的影響，但實(shí)際對青霉素產(chǎn)量并無改進(jìn)。所以青霉素的發(fā)酵罐采用不銹鋼制造為有，其他重金屬離子如銅、汞、鋅等能催化青霉素的分解反應(yīng)。添加苯乙酸或者苯乙酰胺，可以借?；D(zhuǎn)移的作用，將苯乙酸轉(zhuǎn)入青霉素分子，提高青霉素G的生產(chǎn)強(qiáng)度，添加苯氧乙酸則產(chǎn)生青霉素V。因此前體的加入成為青霉素發(fā)酵的關(guān)鍵問題之一。但苯乙酸對發(fā)酵有影響，一般以苯乙酰胺較好。也有人采用苯乙酸月桂醇酯，其優(yōu)點(diǎn)是在發(fā)酵中月桂醇酯水解，苯乙酸結(jié)合進(jìn)青霉素成品。而月桂酸作為細(xì)菌營養(yǎng)劑及發(fā)酵液消沫劑，且其毒性比苯乙酸小，但價格較貴。前體要在發(fā)酵開始20h后加入，并在整個發(fā)酵過程中控制在50^g/ml左右由于在發(fā)酵過程中二氧化碳的不斷產(chǎn)生，加上培養(yǎng)基中有很多有機(jī)氮源含有蛋白質(zhì)，因此在發(fā)酵罐內(nèi)會產(chǎn)生大量泡沫，如不嚴(yán)加控制，就會產(chǎn)生發(fā)酵液逃液，導(dǎo)致染菌的后果。采用植物油消沫仍舊是個好方法，一方面作為消沫劑，另一方面還可以起到碳源作用，但現(xiàn)在已普遍采用合成消沫劑（如聚酯、聚醇類消沫劑）代替豆油。2.6滅菌“滅菌”指的是用化學(xué)或物理的方法殺滅或除去物料及設(shè)備中所有的有生命物質(zhì)的技術(shù)或工藝流程。滅菌實(shí)質(zhì)上可分殺菌和溶菌兩種，前者指菌體雖死，但形體尚存，后者則指菌體殺死后，其細(xì)胞發(fā)生溶化、消失的現(xiàn)象。工業(yè)上常用的方法有：干熱滅菌、濕熱滅菌、化學(xué)藥劑滅菌、射線滅菌和介質(zhì)過濾除菌等幾種。在青霉素的生產(chǎn)中，對培養(yǎng)基和發(fā)酵罐主要采用的是濕熱蒸汽滅菌和空氣過濾除菌的方法。2.7發(fā)酵這一過程的目的主要是為了使微生物分泌大量的抗生素。發(fā)酵開始前，有關(guān)設(shè)備和培養(yǎng)基必須先經(jīng)過滅菌，后接入種子。接種量一般為5?20%。發(fā)酵周期一般為4?5天，但也有少于24小時，或長達(dá)二周以上的。在整個過程中，需要不斷通氣和攪拌，維持一定的罐溫和罐壓，并隔一段時間取樣進(jìn)行生化分析和無菌試驗(yàn)，觀察代謝變化、抗生素產(chǎn)生情況和有無雜菌污染。2.7.1發(fā)酵的過程控制1、碳源控制：青霉菌能利用多種碳源，如乳糖、蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、淀粉和天然油脂等。乳糖是青霉素生物合成的最好碳源，葡萄糖也是比較好的碳源，但必須控制其加入的濃度，因?yàn)槠咸烟且妆痪w氧化并產(chǎn)生抑制抗生素合成酶形成的物質(zhì)，從而影響青霉素的合成，所以可以采用連續(xù)添加葡萄糖的方法代替乳糖。苯乙酸或其衍生物苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等均可作為青霉素G的側(cè)鏈前體。菌體對前體的利用有兩個途徑：直接結(jié)合到產(chǎn)物分子中或作為養(yǎng)料和能源利用，即氧化為二氧化碳和水。前體究竟通過哪個途徑被菌體利用，主要取決于培養(yǎng)條件以及所用菌種的特性。通過比較苯乙酰胺、苯乙酸及苯氧基乙酸的毒性，除苯氧基乙酸外，苯乙酰胺和苯乙酸的毒性取決于培養(yǎng)基的pH和前體的濃度。堿性時，苯乙酰胺有毒；酸性時，苯乙酸毒性較大；中性時，苯乙酰胺的毒性大于苯乙酸。前體用量大于0.1%時，青霉素的生物合成均下降。所以一般發(fā)酵液中前體濃度以始終維持在0.1%為有。在堿性條件下，苯乙酸被菌體氧化的速率隨培養(yǎng)基pH上升而增加。年幼的菌絲不氧化前體，而僅利用它來構(gòu)成青霉素分子。隨著菌齡的增大，氧化能力逐漸增加。培養(yǎng)基成分對前體的氧化程度有較大影響，合成培養(yǎng)基比復(fù)合培養(yǎng)基對前體的氧化量少。為了盡量減少苯乙酸的氧化，生產(chǎn)上多用間歇或連續(xù)添加低濃度苯乙酸的方法，以保持前體的供應(yīng)速率略大于生物合成的需要。2、 pH控制：在青霉素發(fā)酵過程中，pH是通過下列手段控制的：如pH過高，則添加糖、硫酸或無機(jī)氮源；若pH過低，則加入碳酸鈣、氫氧化鈉、氨或尿素，也可提高通氣量。另外，也可利用自動加入酸或堿的方法，使發(fā)酵液pH維持在6.8?7.2，以提高青霉素產(chǎn)量。3、 溫度控制：青霉菌生長的適宜溫度為30°C，而分泌青霉素的適宜溫度是20C左右，因此生產(chǎn)上采用變溫控制的方法，使之適合不同階段的需要。一般一級種子的培養(yǎng)溫度控制在27±1C左右；二級種子的培養(yǎng)溫度控制在25±1C左右；發(fā)酵前期和中期的溫度控制在26C左右；發(fā)酵后期的溫度控制在24C左右。4、 補(bǔ)料控制：發(fā)酵過程中除以中間補(bǔ)糖控制糖濃度及pH夕卜，補(bǔ)加氮源也可提高發(fā)酵單位。經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)：若在發(fā)酵60?70h開始分次補(bǔ)加硫酸銨，則在90h后菌絲含氮量幾乎不下降，維持在6%?7%,,且60%?70%的菌絲處于年幼階段，菌絲呼吸強(qiáng)度維持在二氧化碳量近30^1/（mg菌絲?h）,抗生素產(chǎn)率為最高水平的30%~40%；而不加硫酸銨的對照罐，在發(fā)酵中期菌絲含氮量為7%,以后逐級下降。至發(fā)酵結(jié)束時為4%。發(fā)酵結(jié)束時呼吸強(qiáng)度降至二氧化碳量為16^1/（mg菌絲?h）,且抗生素產(chǎn)量下降至零，總產(chǎn)量僅為試驗(yàn)罐的1/2。因此，為了延長發(fā)酵周期，提高青霉素產(chǎn)量，發(fā)酵過程分次補(bǔ)加氮源也是有效的措施。5、鐵離子的影響：三價鐵離子對青霉素生物合成有顯著影響，一般若發(fā)酵液中鐵離子含量超過 30?40ug/ml,則發(fā)酵單位增長緩慢。鐵離子對產(chǎn)黃青霉綠色孢子合成青霉素的影響見下表。因此鐵罐在使用前必須進(jìn)行處理，可在罐壁涂上環(huán)氧樹脂等保護(hù)層，使鐵離子含量控制在30ug/ml以下。2.7.2防止染菌的要點(diǎn)染菌是抗生素發(fā)酵的大敵，不制服染菌就不能實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)。影響染菌的因素很多，而且?guī)щS機(jī)性質(zhì)，但只要認(rèn)真對待，過細(xì)地工作，染菌是可以防止的。請到左邊的導(dǎo)航欄里選擇查看防止染菌的要點(diǎn)的內(nèi)容。2.7.3空氣系統(tǒng)的要求防止空氣帶菌主要是提高空壓機(jī)進(jìn)口空氣的潔凈度，防止空氣夾帶油和水及空氣過濾器失效。提高空壓機(jī)進(jìn)口空氣的潔凈度，可以從提高吸氣口的位置及加強(qiáng)空氣的壓縮前過濾著手。防止空氣夾帶油、水，除加強(qiáng)去除油、水的措施外，還必須防止空氣冷卻器漏水，注意勿使冷卻水壓力大于空氣壓力，防止冷卻水進(jìn)入空氣系統(tǒng)。2.7.4蒸汽系統(tǒng)的要求重視飽和蒸汽的質(zhì)量，要嚴(yán)防蒸汽中夾帶大量冷凝水，防止蒸汽壓力大幅度波動，保證生產(chǎn)時所用的蒸汽壓力在30?35千帕以上。1、 連續(xù)滅菌設(shè)備：連消塔結(jié)構(gòu)要求簡單，易于拆裝和清理，操作時蒸汽能與物料混合均勻，并易于控制溫度。2、 發(fā)酵罐：發(fā)酵罐及其附屬設(shè)備應(yīng)注意嚴(yán)密和防止泄漏，避免形成“死角”。凡與物料、空氣、下水道連接的閥門都必須保證嚴(yán)密度。3、 無菌室：用超凈工作臺及凈化室代替無菌室，以提高無菌程度。第三章提煉工藝過程3.1發(fā)酵液預(yù)處理發(fā)酵液中的雜質(zhì)如高價無機(jī)離子（Fe2+、Ca2+、Mg2+）和蛋白質(zhì)在離子交換的過程中對提煉影響甚大，不利于樹脂對抗生素的吸收。如用溶媒萃取法提煉時，蛋白質(zhì)的存在會產(chǎn)生乳化，使溶媒合水相分離困難。對高價離子的去除，可采用草酸或磷酸。如加草酸則它與鈣離子生成的草酸鈣還能促使蛋白質(zhì)凝固以提高發(fā)酵濾液的質(zhì)量。如加磷酸(或磷酸鹽)，既能降低鈣離子濃度，也利于去除鎂離子。Na5P3O10+Mg2+====MgNa3P3O10+2Na+加黃血鹽及硫酸鋅，則前者有利于去除鐵離子，后者有利于凝固蛋白質(zhì)。此外，兩者還有協(xié)同作用。他們所產(chǎn)生的復(fù)鹽對蛋白質(zhì)有吸附作用。2K4Fe(CN)6, + ; 3ZnSO4K2Zn[Fe(CN)6]2 +2Na+為了有效的去除發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)，需加入絮凝劑。絮凝劑是一種能溶于水的高分子化合物。含有很多離子化基團(tuán)(如一NH2，—COOH，—OH)。3.2提取化學(xué)提取和精制的目的：從發(fā)酵液中制取高純度的、合乎藥典的抗生素成品。由于發(fā)酵液中青霉素濃度很低，僅0.1?4.5%左右，而雜質(zhì)濃度比青霉素的高幾十倍甚至幾千倍，并且某些雜質(zhì)的性質(zhì)與抗生素的非常相近，因此提取精制是一件十分重要的工作。發(fā)酵液中常見的雜質(zhì)有：菌絲、未用完的培養(yǎng)基、易污染雜菌、產(chǎn)生菌的代謝產(chǎn)物、預(yù)處理需要加入的雜質(zhì)等。在提煉過程中要遵循下面四個原則：1、 時間短2、 溫度低3、 pH適中4、勤清洗消毒常用的提取方法有溶媒萃取法、離子交換法和沉淀法等。1、 溶媒萃取法這是利用抗生素在不同的pH值條件下以不同的化學(xué)狀態(tài)（游離態(tài)、堿或鹽）存在時，在水及水互不相溶的溶媒中溶解度不同的特性，使抗生素從一種液相（如發(fā)酵濾液）轉(zhuǎn)移到另一種液相（如有機(jī)溶媒）中去，以達(dá)到濃縮和提純的目的。利用此原理就可借助于調(diào)節(jié)pH值得方法時抗生素從一個液相中被提取到另一液相中去。所選用的溶媒與水應(yīng)是互不相溶或僅很小部分互溶，同時所選溶媒在一定的pH下對于抗生素應(yīng)有較大的溶解度和選擇性，方能用較少量的溶媒使提取完全，并在一定程度上分離掉雜質(zhì)。2、 離子交換法利用離子交換樹脂和抗生素之間的化學(xué)親和力，有選擇性的將抗生素吸附上去，然后以較少量的洗脫劑將它洗下來。3、 沉淀法是一種分離抗生素簡單而經(jīng)濟(jì)的方法，濃縮倍數(shù)高，因而也是很有效的方法。青霉素的提取采用溶媒萃取法。青霉素游離酸易溶于有機(jī)溶劑，而青霉素鹽易溶于水。利用這一性質(zhì)，在酸性條件下青霉素轉(zhuǎn)入有機(jī)溶媒中，調(diào)節(jié)pH，再轉(zhuǎn)入中性水相，反復(fù)幾次萃取，即可提純濃縮。選擇對青霉素分配系數(shù)高的有機(jī)溶劑。工業(yè)上通常用醋酸丁酯和戊酯。萃取2—3次。從發(fā)酵液萃取到乙酸丁酯時，pH選擇2.8-3.0，從乙酸丁酯反萃到水相時，pH選擇6.8-7.2。為了避免pH波動，采用硫酸鹽、碳酸鹽緩沖液進(jìn)行反萃。所得濾液多采用二次萃取，用10%硫酸調(diào)pH2.8?3.0,加入醋酸丁酯。在一次丁酯萃取時，由于濾液含有大量蛋白，通常加入破乳劑防

止乳化。第一次萃取，存在蛋白質(zhì)，加0.05-0.1%乳化劑PPB。3.3精制這是青霉素生產(chǎn)的最后工序。對產(chǎn)品進(jìn)行精制、烘干和包裝的階段要符合“藥品生產(chǎn)管理規(guī)范”的規(guī)定。3.3.1脫色和去熱原質(zhì)脫色和去熱原質(zhì)是精制注射用青霉素中不可缺少的一步。色素是在發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，它與菌種和發(fā)酵條件有關(guān)。熱原質(zhì)是在生產(chǎn)過程中由于被污染后雜菌所產(chǎn)生的一種內(nèi)毒素。生產(chǎn)中一般用活性炭脫色去熱原質(zhì)，但需注意脫色時pH、溫度、活性炭用量及脫色時間等因素，還應(yīng)考慮它對抗生素的吸附問題，否則影響收率。3.3.2結(jié)晶抗生素精制常用結(jié)晶法來制得高純度成品。常用的幾種結(jié)晶方法有：1、 改變溫度結(jié)晶利用抗生素在溶劑中的溶解度隨溫度變化而顯著變化的這一特性來進(jìn)行結(jié)晶。2、 利用等電點(diǎn)結(jié)晶當(dāng)將某一抗生素溶液的pH調(diào)到等電點(diǎn)時，它在水溶液中溶解度最小，則沉淀析出。3、 加成鹽劑結(jié)晶在抗生素溶液中加成鹽劑使抗生素以鹽的形式從溶液中能夠沉淀結(jié)晶。CHi4-CHaCOONaR—COHH+CHJCOOHCHi4-CHaCOONaR—COHH+CHJCOOH醋酸丁酯中含水量過高會影響收率，但可提高晶體純度。水分在0.9%以下對收率影響較小。得到的晶體要求顆粒均勻，有一定的細(xì)度。顆粒太細(xì)會使過濾、洗滌困難。晶體經(jīng)丁醇洗滌，真空干燥即可等到成品。3.4成品鑒定成品鑒定是根據(jù)藥典的要求逐項(xiàng)進(jìn)行分析，包括效價鑒定、毒性試驗(yàn)、無菌檢查、熱源質(zhì)試驗(yàn)、水分測定、水溶液酸堿度及混濁度測定、結(jié)晶顆粒的色澤及大小的測定等。對于藥典上未有規(guī)定的新抗生素，則可參照相近抗生素，按經(jīng)驗(yàn)規(guī)定一些指標(biāo)。酸堿度檢測取本品，加水制成每1ml中含30mg的溶液，測定。 pH值應(yīng)為5.0?7.5。溶液的澄清度與顏色取樣品0.3g,加水5ml使溶解，溶液應(yīng)澄清無色；如顯渾濁，與濁度標(biāo)準(zhǔn)液比較，均不得更濃；如顯色，與黃色或黃綠色標(biāo)準(zhǔn)比色液比較，均不得更深。吸光度取樣品，加水制成每1ml中含1.80mg的溶液，在280nm的波長處測定吸光度，不得大于0.10；在264nm的波長處有最大吸收，吸光度應(yīng)為0.80?0.88。細(xì)菌內(nèi)毒素取樣品測定，每100青霉素單位中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于0.01EU。無菌取樣品，用青霉素酶法滅活后或用適宜溶劑溶解后，轉(zhuǎn)移至不少于500ml的0.9%無菌氯化鈉溶液中，用薄膜過濾法處理后測定。效價測定取本品適量，精密稱定，加水溶液并定量稀釋制成每1ml中約含0.5mg的溶液，搖勻，精密量取

10U1,注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取青霉素對照品適量，同法測定。按外標(biāo)以峰面積計算，其結(jié)果乘以1.0658,即為本品效價。每1mg相當(dāng)于1670青霉素單位。3.5成品分裝抗生素產(chǎn)品一般分裝為大包裝的原料藥，以供制劑廠進(jìn)行小包裝或制劑加工。也有一些抗生素工廠在無菌條件下用自動分裝機(jī)進(jìn)行小瓶分裝。第四章操作規(guī)程4.1發(fā)酵工藝過程4.1.1正常發(fā)酵（過程）1進(jìn)料（基質(zhì)），開備料泵2、2、開備料閥3備料后（罐重100000KG）關(guān)備料閥3、4關(guān)備料泵、5、開攪拌器6設(shè)置攪拌轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)、7開通風(fēng)閥、8開排氣閥、9投加菌種、10補(bǔ)糖，開補(bǔ)糖閥LU、11補(bǔ)氮，開加硫銨閥>12開冷卻水，維持溫度在25°C［匕、13PH值保持在一定范圍內(nèi)、14、前體超過1KG/M3（扣分步驟，出現(xiàn)則扣分）4.1.2出料1停止進(jìn)空氣、2停攪拌、3關(guān)閉所有進(jìn)料，開閥出料、4.1.3發(fā)酵過程中PH值低調(diào)節(jié)PH值開大氨水流量PH值指標(biāo)4.1.4發(fā)酵過程中PH值高關(guān)閉進(jìn)氨水開大補(bǔ)糖閥調(diào)節(jié)PH值

4.1.5發(fā)酵過程中溶解氧低開大進(jìn)空氣閥V02調(diào)節(jié)溶解氧大于30%4.1.6殘?zhí)菨舛鹊烷_加糖閥補(bǔ)糖開通冷卻水進(jìn)水冷卻溫度指標(biāo)4.1.7發(fā)酵過程中溫度高4.1.7發(fā)酵過程中溫度高1=14.1.8泡沫高添加消泡劑泡沫高度降低到30CM4.2提煉工藝過程4.2.1預(yù)處理操作1打開閥V14，加發(fā)酵液。、2、待加料至5000kg時，關(guān)閉閥V14。3打開預(yù)處理罐攪拌器、4打開閥V13，加黃血鹽，去除鐵離子。、5觀察鐵離子濃度變化，待鐵離子濃度為零時，關(guān)閉、閥V13。6打開閥V12,加磷酸鹽，去除鎂離子。、7觀察鎂離子濃度變化，鎂離子濃度為零時，關(guān)閉閥、V12。8打開閥V11，加絮凝劑，去除蛋白質(zhì)。、9觀察蛋白質(zhì)濃度變化，蛋白質(zhì)濃度為零時，關(guān)閉閥、V11。

10打開閥V16、V17及泵P5,同時打開轉(zhuǎn)筒過濾器LU、開關(guān)及后閥V18。11待發(fā)酵液經(jīng)過濾排至混合罐B101后，關(guān)閉閥V16、>V17、泵P5以及轉(zhuǎn)筒過濾器開關(guān)及后閥V18。12停止預(yù)處理罐攪拌器。［匕、4.2.2—次BA萃取操作1打開混合罐B101攪拌器、2打開閥V19,加BA（醋酸丁酯）質(zhì)量為發(fā)酵液的、1/4?1/3倍。3關(guān)閉閥V19。3、4打開閥V22，加稀硫酸調(diào)節(jié)PH值。、5待PH值調(diào)節(jié)至2?3時，關(guān)閉閥V22。5、6打開閥V21，加破乳劑。、7、加破乳劑量為100kg時，關(guān)閉閥V21。8打開閥V23、V24及泵？6，向分離機(jī)注液。、9待分離機(jī)中有液位時，迅速打開A101開關(guān)。、10打開萃余相回收閥V26，調(diào)節(jié)V26閥門開度，控、制重相液位在總液位的80%左右，使輕相液能充分的溢流至B102。11、12、11、12、13、待混合罐B101液體排空后，關(guān)閉閥V23、V24及泵P6。停止混合罐B101攪拌器。待分離機(jī)A101中液體排盡后，關(guān)閉閥V26。14關(guān)閉分離機(jī)A101開關(guān)、4.2.3—次反萃取操作1、打開混合罐B102攪拌器。1、2打開V28,加碳酸氫鈉溶液，質(zhì)量為青霉素溶液的、3?4倍，并調(diào)節(jié)PH值為7?83待PH值調(diào)節(jié)至7?8時，關(guān)閉閥V28。3、4打開閥V29、V30及泵P7,向分離機(jī)A102注液。、5待分離機(jī)A102中有液位時，迅速打開A102開關(guān)。、6打開萃余相回收閥V32,調(diào)節(jié)V32閥門開度，控、制重相液位在總液位的80%左右，輕相液能充分的溢流出。7、8、7、8、9、待混合罐B102液體排空后，關(guān)閉閥V29、V30及泵P7。停止混合罐B102攪拌器。待分離機(jī)中剩余少許重液時，關(guān)閉閥V32,防止輕液流入混合罐B103中10關(guān)閉分離機(jī)A102開關(guān)、4.2.4二次BA萃取操作1打開混合罐B103攪拌器。、2打開閥V33,加BA（醋酸丁酯）質(zhì)量為發(fā)酵液的、1/4?1/3倍。3關(guān)閉閥V33。3、4打開閥V35，加稀硫酸調(diào)節(jié)PH值。、5待PH值調(diào)節(jié)至2?3時，關(guān)閉閥V35。5、6打開閥V36、V37及泵P8。6、7待分離機(jī)中有液位時，迅速打開A103開關(guān)。、8打開萃余相回收閥V39,調(diào)節(jié)V39閥門開度，控、制重相液位在總液位的80%左右，使輕相液能充分的溢流至脫色罐中。9待混合罐B103液體排空后，關(guān)閉閥V36、V37、及泵P8。10停止混合罐B103攪拌器。LU、11待分離機(jī)A103中液體排盡后，關(guān)閉閥V39。>12關(guān)閉分離機(jī)A103開關(guān)。［匕、4.2.5脫色罐操作1打開活性炭進(jìn)料閥。、2、 選擇進(jìn)料量，進(jìn)料25kg3、 進(jìn)料、4關(guān)閉進(jìn)料閥。、5打開脫色罐攪拌器，并設(shè)定攪拌時間：10min、6攪拌10mm后，打開閥V41、V42及泵P9,將、青霉素溶液經(jīng)過過濾器排至結(jié)晶罐。7待脫色罐液體排空后，關(guān)閉閥V41、V42及泵P9。、8停止脫色罐攪拌器。、4.2.6結(jié)晶罐及抽濾、干燥操作1啟動結(jié)晶罐攪拌器、2打開閥V43，向結(jié)晶罐中加入醋酸鈉乙醇溶液。、3觀察青霉素濃度，待青霉素剛好反應(yīng)完時，關(guān)閉閥、V43。4打開冷卻水閥V44及VD10，控制結(jié)晶罐溫度為、5°C以下，并輸入保持時間，保持10min。5打開閥V45、V46及泵P10,將結(jié)晶液排至真空、抽濾機(jī)進(jìn)行抽濾6待真空抽濾機(jī)中上層液位達(dá)到50%左右后，迅速打、開真空閥V47，進(jìn)行抽濾。7同時打開V48,回收母液。、8待結(jié)晶罐中液體排空后，關(guān)閉閥V45、V46及泵、P10。9停止結(jié)晶罐攪拌器、10抽濾完成后，關(guān)閉真空閥V47o、11待母液全部回收后，關(guān)閉閥V48o、12點(diǎn)擊“移出晶體”按鈕，將抽濾后的晶體移入洗滌、罐。13打開閥V49,加丁醇進(jìn)行洗滌。、14、待丁醇加入量為500kg時，關(guān)閉閥V49o15啟動洗滌罐攪拌器，并設(shè)定時間為8mino、16停止洗滌罐攪拌器。并設(shè)定時間，保持10min。、17打開閥V50，排出廢洗液。、18待廢洗液排盡后，關(guān)閉閥V50o、19點(diǎn)擊“移出晶體”，將洗滌后的晶體移至真空干燥機(jī)。、20啟動干燥機(jī)，進(jìn)行干燥，并設(shè)定時間為20min、21關(guān)閉干燥機(jī)開關(guān)，停止干燥。第五章主要操作畫面5.1青霉素工藝流程界面由胞行t主理茬"KX) 由胞行t主理茬"KX) i5：l2一世艮草田_g|hi母制a_IWi I青霉素生產(chǎn)工藝過程5.2菌種介紹界面菌種介籍青翊產(chǎn)生胥席麗堤戛芯機(jī)廣長分布〒玄t盅浪和各科站|上，缺生說在倒：世的柑怕皮上號if舜％日而己發(fā)現(xiàn)幾百神＞其中產(chǎn)黃青辱(FistdflllukeJjrys＜ift￡tiui)-.點(diǎn)青善咨如口111項(xiàng) 大量產(chǎn)生青■稼素.:■齋季季的宣現(xiàn)和太強(qiáng)栓地生產(chǎn)，應(yīng)用.時F/L生手工業(yè)的左展起了巨大的茬動作用■,百再苞苗絲與由毒相他.但沒有ffi￡EJ&.：.計生苞子地頂始不JU尢，無偵蛋.竺卒找分就產(chǎn)生兒能對秫匝不對耕小帆小搜對產(chǎn)生赤申的青色島生抱手，抱子踞如掃4a緒氓工藝磴泡子由圈種子吊a緒氓工藝磴泡子由圈種子吊JtSSfffiS田責(zé)酷工圣景作xsxn竺條命壁些牌_、.1.曾珂表函B頗tt)~|xa^r-s?|ISLE-I口IMl花子制備這是發(fā)啟工停到開讖昆一個重宴環(huán)節(jié)?？股禺a(chǎn):T口成品質(zhì)量同菌仲性亳以喪冏胞子和沖手的情我南密切是系』生產(chǎn)用的抱于席姓過郵利生產(chǎn)能力的隹酷.特舍蜿定的才胡用來制4■林子。劇I錐砂土修成猝府千慷管神的曲神姓無誼芋嫉揍「僥含手泡子吱券或殿生長掀面堵芥基中,世斜面＜■時于產(chǎn)抱于劇I錐砂土修成猝府千慷管神的曲神姓無誼芋嫉揍「僥含手泡子吱券或殿生長掀面堵芥基中,世斜面＜■時于產(chǎn)抱于SE弁強(qiáng)的恐抱于"芽、生怯.繁箔快的苞神可以采用團(tuán)您培養(yǎng)菟胞子，子也于可直匹任為中子珞的神子■:...■壬茵,?MM案工邑海程泡子制番樣于順岌畔工己搜柞工芝潭件15.12ESM?伽審綠」 ..-早痕垣5.45.4種子制備界面■hiirr#果

日H)MM>!NHir>-M巷接天耕詹養(yǎng)是瓦制電子制備卻■hiirr#果

日H)MM>!NHir>-M巷接天耕詹養(yǎng)是瓦制電子制備卻子制備夏腳曜櫬陣1281件坨奔基的買固有汁H滸和連好耐.廿批滅幽是博配郵的悟舞基缺入瀕8申，if入蒸汽.使培榛基和所有設(shè)有■-起我茴.這T±整也吊力宙旅成苜.連細(xì)i藺是在配*蝶的培養(yǎng)基目發(fā)稿略瞄同叱如熱.徐瓠和冷即,頑;整十滅茵過程.MWUKV-.iTMZK皿■aiuin，岫 liRTWi-we備畢2g4MAKU>4映"伸曲*tg由滯5rntUF'WH訪眼配午TIM?”皿”.?4 --A'dlh*iSKi?i4hA實(shí)蠢天菌t<S集散倒見!S 單以話行C采15按姬郊鹽。LSdZ5.6培養(yǎng)基制備界面JBTFSEXTTJ 近皿_1_工5.8發(fā)酵罐操作界面砒0如同GJ料于制者JLQIiQXfr瑁養(yǎng)基配制 |專晴工出徘| 發(fā)瞞最作injx??EI5iit程E?-frt0g種醐羊靴L：.<￡jJt+'±F卅'0.00成“I」吠幼西J士N,bfiUI-#—^■W-；EI驢格電■限口一-尚網(wǎng)釁-MAtl-K5.9菌種曲線界面Ifl4〔2產(chǎn)堤圖，F(xiàn)!林k|麗|W；京東方防寞5.10預(yù)處理界面革機(jī)逮仔I先諄褸牧雌由2U0FFB|LdiCG-口］RMgE-口］RMgE腿矽-一一一?一5.11提取流程總?工藝ii面rA礪?分離》UI5一次EA萃取珂St理青尊素提取HtHDCd港言JBEIg一次反萃取分曾抓|1|03快莘取.提審源程總睨精*篩程總睨—枕Ei萃取曲或，曲或，"Hft一"莘甲:ft^wrattss 、k —I單雌b『擊倒蝴WK』皿*Iisle5.12一次BA萃取界谷

5.13精制流程總貌5.14脫色操作界面

5.17成品鑒定界面工藝荷面m成品要定RM.JtSiW齡乩加寸出喊每Ml中臺札E的溶而湄定, 用值莊為5.0--7.51陪渣的液清世與摑色乍祥Jio.3g.IP木5」便渤S，浴渣應(yīng)適清無色I(xiàn)加顯陶蟲，與泊度捍清技比校，劫不徊更洶如呈包與黃色罪黃鼻色驚淮比色債比較，均不得更涂.弱無.亶IR樣品，加*割成錚Ml中皆1.即《&1帝液，莊Z3M的彼長處遇定Rbt軍不潭玄于tklQi在躊蛔的族長it有雖大哄恨-吸夫Bt成煩.9gU.四iff菌內(nèi)毒豪般樣品測定，每m(*#豪宅位中自內(nèi)毒來的?應(yīng)』于nflFU.無菌勒￥品，同青廠素18法無話恒或用適宜海Uhfl解岳，9$精主不：1■于5U如1的Cl尊無言箕此揪郴中-用薄審過漆注融觀曰潮定+做犯型本品適低揩密!stIff水涪供并也晰th?!帆成據(jù)偵中當(dāng)圭Cl局巧的溶洛掛可WSS^Lbul,連兒用目色譜總記「.色詢倒f取看*鞘國品適玖15世引瓦.花"疽或14嘛計虬其蝸果麻m.0fi5EL即ga劉污1畦凋當(dāng)于L6TDW雷嘛單疫，W碧素1$碑珀地理挹蹄程成描郵罹漩—布臭瘁眼一改辰章.「二儀&^審峻他捧住翊品臻住拍濾?.干燥'乎中外國徵面5，|itKt.u7.i9lEdi

骨MT荒工蘭流程jwsIffWi酸.?,T崖茸匪骨MT荒工蘭流程jwsIffWi酸.?,T崖茸匪二設(shè)hU?膜色操Ft眥..干蜂mtfrm產(chǎn)路分裝耆琲盤曲由白色詁壬性粉京；無臭或訥有特畀性勤有引濕性；遇曲、堿或直41利等即迅誼丑蜘.水做在室慕丑他宣明關(guān)池.桂測色格啟諺呈削劑「，道行劑成片劑取生產(chǎn)包怯,U下是青尊耋汁劑的包裝生產(chǎn)淺-第六章主要工藝指標(biāo)編號指標(biāo)推薦值發(fā)酵罐1糖濃度?5kg/m3—— X 2氨氮含量0.25?0.3kg/m