微生物生理-微生物的生長(zhǎng)與繁殖

測(cè)定微生物總數(shù)主要內(nèi)容顯微鏡直接計(jì)數(shù)法

光電比濁計(jì)數(shù)法顯微鏡直接計(jì)數(shù)法顯微鏡直接計(jì)數(shù)法是將小量待測(cè)樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上，于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)的一種簡(jiǎn)便、快速、直觀的方法。直接計(jì)數(shù)法優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：直觀、快速、操作簡(jiǎn)單。缺點(diǎn)：不能區(qū)分死菌與活菌，所得為總數(shù)；不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)。顯微鏡直接計(jì)數(shù)法常用計(jì)數(shù)器有血球計(jì)數(shù)板(血細(xì)胞計(jì)數(shù)板)、Petroff-Hauser計(jì)菌器以及Hawksley計(jì)菌器等。各種計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)原理相同，只是血球計(jì)數(shù)板較厚，不能使用油鏡觀察，只能計(jì)數(shù)較大的霉菌孢子和酵母菌；而后兩種計(jì)菌器細(xì)菌，可以使用油鏡觀察，因此可以直接計(jì)數(shù)細(xì)菌。顯微鏡直接計(jì)數(shù)法

血球計(jì)數(shù)板

Petroff-Hauser計(jì)菌器Hawksley計(jì)菌器顯微鏡直接計(jì)數(shù)法血球計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)；中間較寬的平臺(tái)又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺(tái)上各列有一個(gè)方格網(wǎng)。顯微鏡直接計(jì)數(shù)法每個(gè)方格網(wǎng)共分為九個(gè)大方格，中間的大方格即為計(jì)數(shù)室。計(jì)數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格：一種是一個(gè)大方格分成25個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格；另一種是一個(gè)大方格分成16個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格。顯微鏡直接計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)方法使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時(shí)，通常數(shù)5個(gè)中方格的總菌數(shù)A，然后求每個(gè)中方格的平均值，再乘上大方格（計(jì)數(shù)室）中方格的數(shù)量，就得出一個(gè)大方格中的總菌數(shù)。數(shù)兩個(gè)大方格總菌數(shù)，平均后，再換算成每毫升菌液中微生物細(xì)胞的數(shù)量。光電比濁計(jì)數(shù)法基本原理：當(dāng)光線通過(guò)微生物菌懸液時(shí)，由于菌體的散射及吸收作用使光線的透過(guò)量降低。在一定范圍內(nèi)，微生物細(xì)胞濃度與透光度成反比，與光密度成正比，而光密度或透光度可以由光電池精確測(cè)出。因此，可用一系列已知菌數(shù)的菌懸液測(cè)定光密度，作出光密度-菌數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后，以樣品液所測(cè)得的光密度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出對(duì)應(yīng)的菌數(shù)。比濁法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、快速、連續(xù)測(cè)定、適合自動(dòng)化。缺點(diǎn)：光密度受細(xì)胞大小、形態(tài)、培養(yǎng)液成分

以及選用的波長(zhǎng)的影響；對(duì)于不同微生物的菌懸液要選擇相應(yīng)的

菌株和培養(yǎng)條件制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；對(duì)于顏色太深的樣品或含其它具有吸光

值的物質(zhì)不能用此法。比濁法的操作步驟標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作1、血球計(jì)數(shù)板直接計(jì)數(shù)：首先采用血球計(jì)數(shù)直接計(jì)數(shù)釀酒酵母菌懸液。2、稀釋菌液：將上述已知濃度的釀酒酵母菌懸液用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行兩倍梯度稀釋，共稀釋6個(gè)濃度。3、測(cè)OD值：以無(wú)菌生理鹽水作為對(duì)照，于波長(zhǎng)560nm處用1cm比色杯測(cè)定上述各菌液的OD值。4、以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，每毫升菌數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。比濁法的操作步驟樣品的測(cè)定1、稀釋樣品：將待測(cè)菌懸液用無(wú)菌生理鹽水適當(dāng)稀釋。2、在560nm波長(zhǎng)用1cm比色皿測(cè)定稀釋后菌懸液的光密度。3、計(jì)算：根據(jù)所測(cè)得的光密度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得每毫升的含菌數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)就得到原液中細(xì)菌數(shù)。小結(jié)

1)顯微鏡直接計(jì)數(shù)法：直觀、快速、易操作；不能區(qū)分死菌和活菌，也不適于運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)；

2)光電比濁計(jì)數(shù)法：簡(jiǎn)便、快速適合連續(xù)自動(dòng)化；影響光密度的因素較多，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作要求較高，對(duì)于顏色太深或含其它具有吸光值物質(zhì)的樣品不能用此法。測(cè)定活菌數(shù)和生長(zhǎng)量主要內(nèi)容1活菌數(shù)測(cè)定法2測(cè)定微生物生長(zhǎng)量

1活菌數(shù)測(cè)定法1.1平板菌落計(jì)數(shù)法1.2液體稀釋測(cè)定法1.3膜過(guò)濾計(jì)數(shù)法1.1平板活菌計(jì)數(shù)法b.稀釋倒平板法操作較麻煩，對(duì)好氧菌、熱敏感菌效果不好！a.涂布平板法使用較多的常規(guī)方法，但有時(shí)涂布不均勻！1.2液體稀釋測(cè)定法

測(cè)定不占優(yōu)勢(shì)，但具有某種特殊生理功能的類群。X5X5X5X5

稀釋度

10-3

10-4

10-5

10-6

10-7

10-8

重復(fù)數(shù)

5

5

5

5

5

5

出現(xiàn)生長(zhǎng)的管數(shù)

5

5

5

3

1

01.3膜過(guò)濾計(jì)數(shù)法硝酸纖維素膜測(cè)定空氣、水等含菌量低的樣品當(dāng)中的活菌數(shù)2測(cè)定微生物生長(zhǎng)量2.1重量測(cè)定法2.2細(xì)胞組分含量測(cè)定法2.3菌絲長(zhǎng)度測(cè)定法2.4生理指標(biāo)測(cè)定法2.1重量測(cè)定法

將一定體積樣品中的菌體通過(guò)離心或過(guò)濾的方法分離出來(lái)，用水洗凈附在細(xì)胞表面的殘留培養(yǎng)基，再次離心后直接稱重，即為濕重。

若將濕重樣品在105℃烘干或真空下干燥至恒重，即為干重。微生物的干重一般為其濕重的10%～20%。干重法直接而又可靠，但要求被測(cè)菌體濃度較高，樣品中不含或少含不溶性雜質(zhì)。2.2細(xì)胞組分含量測(cè)定法2.2.1蛋白質(zhì)含量測(cè)定法

蛋白質(zhì)是微生物細(xì)胞的主要成分，含量也比較穩(wěn)定，蛋白質(zhì)含量可反映微生物的生長(zhǎng)量。氮是蛋白質(zhì)的重要組成元素，從一定體積的樣品中分離細(xì)胞，洗滌后，用凱氏定氮法或雙縮脲法測(cè)出含氮量。蛋白質(zhì)含氮量為16％，因此，總含氮量與細(xì)胞蛋白質(zhì)總量的關(guān)系可按下式計(jì)算：

蛋白質(zhì)總量＝含氮量×6.252.2細(xì)胞組分含量測(cè)定法2.2.2DNA含量測(cè)定法DNA是微生物的重要遺傳物質(zhì)，其含量較為恒定，不易受菌齡和環(huán)境因素的影響。該方法是基于DNA與3，5-二氨基苯甲酸-鹽酸結(jié)合能顯示特殊熒光的原理，定量測(cè)定菌懸液中的熒光強(qiáng)度，求得DNA含量。每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞DNA平均含量為8.4×10-11mg，可根據(jù)DNA含量計(jì)算出細(xì)菌的數(shù)量。2.3菌絲長(zhǎng)度測(cè)定法

絲狀微生物的生長(zhǎng)可用一定時(shí)間內(nèi)其菌絲的生長(zhǎng)長(zhǎng)度來(lái)表示。

測(cè)定方法是將絲狀真菌接種到固體培養(yǎng)基上，定時(shí)測(cè)定菌絲伸展的長(zhǎng)度或面積。對(duì)于生長(zhǎng)快的菌類每24h測(cè)定1次，對(duì)于生長(zhǎng)慢的菌類可數(shù)天測(cè)定1次。該法的缺點(diǎn)是不能反映菌絲的縱向生長(zhǎng)，即菌落的厚度和生長(zhǎng)到培養(yǎng)基內(nèi)部的菌絲生長(zhǎng)，并且接種量也會(huì)影響測(cè)定結(jié)果。2.4生理指標(biāo)測(cè)定法

通過(guò)測(cè)定細(xì)胞的生理指標(biāo)來(lái)測(cè)定微生物生長(zhǎng)量，與微生物生長(zhǎng)量相平行的生理指標(biāo)有耗氧量、呼吸強(qiáng)度、酶活性、生物熱等。根據(jù)微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中伴隨出現(xiàn)的這些指標(biāo)，樣品中微生物數(shù)量多或生長(zhǎng)旺盛，這些指標(biāo)愈明顯，因此可以借助特定的儀器，如瓦勃