生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗技術(shù)-第一次(分光 層析)

生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗技術(shù)ExperimentaltechnologyofBiochemistryandmolecularbiology《生物化學(xué)與分子生物學(xué)》《生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗技術(shù)》理論考試（60分）實驗成績（40分）理論課：3學(xué)時

×3次實驗課:6學(xué)時

×6次操作考試：3學(xué)時學(xué)時考試3.5學(xué)分2.5學(xué)分《生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗技術(shù)》成績分布理論考試（60分）：選擇題（15題，15分）判斷題（15題，15分）填空題（15個空，15分）論述題（1題，15分）實驗成績（40分）:實驗操作考試（10分）實驗報告（15分）實驗討論（10分）考勤和衛(wèi)生（5分）Thebasicexperimentaltechnology：一、分光光度技術(shù)二、層析技術(shù)三、電泳技術(shù)四、離心分析技術(shù)五、PCR技術(shù)六、蛋白分離和純化技術(shù)

一、分光光度技術(shù)

(Spectrophotometry)

722型分光光度計的旋鈕上標示的0、100、A、T分別表示什么意思？分光光度法檢測物質(zhì)濃度時為什么要用空白液？將兩個空比色杯放入分光光度計，以一個比色杯作為對照，測另一個比色杯的吸光度。Contents：一)光的概述二)分光光度法的概念及原理四)測定物含量的計算三)分光光度計的構(gòu)造及使用方法一)光的概述（lightwave）1.光的性質(zhì)光是電磁波，通常用波長、頻率來描述不同的光波。波速=波長×頻率

不同波長(或不同頻率)的電磁波在相同介質(zhì)中的傳播速度都相同，電磁波的頻率愈高，波長越短。一定波長的光具有一定的能量，波長越長（頻率越低），光量子的能量越低；反之，波長越短（頻率越高），光量子的能量越高。溶液的顏色與吸收光顏色的關(guān)系紫外光：＜400nm可見光：400～760nm紅外光：＞760nm

另根據(jù)電磁波的波長不同又分為三個波段：可見光：電磁波譜中人眼可以感知的部分，波長在400到760納米之間，往往是具有顏色的光。實驗證明：白光(日光、白熾電燈光、日光燈光等)就是由以上不同顏色的光按一定的強度比例混合而成的。白光叫做復(fù)合光；只具有一種顏色的光/同一波長的光叫做單色光。溶液的顏色與吸收光顏色的關(guān)系

為什么以上多種有顏色的單色光混合在一起即變?yōu)榘坠猓炕パa光（complementarycolors）：——把適當顏色的兩種光按一定強度比例混合能成為白光，這兩種顏色的光稱為互補光。2.介質(zhì)對光波的吸收光在介質(zhì)內(nèi)傳播時，介質(zhì)中的束縛電子在光波電場作用下做受迫振動，光波要消耗能量激發(fā)電子的振動，導(dǎo)致介質(zhì)中的分子（或離子）由基態(tài)躍遷到高能級的激發(fā)態(tài)。光的吸收：是指原子在光照下，會吸收光子的能量由低能態(tài)躍遷到高能態(tài)的現(xiàn)象。只要是介質(zhì)，就會吸收各種光波？介質(zhì)吸收光的條件：而物質(zhì)的基態(tài)和激發(fā)態(tài)是由物質(zhì)的原子構(gòu)成和原子間相互作用決定的，不同物質(zhì)由于其分子結(jié)構(gòu)不同，導(dǎo)致物質(zhì)能態(tài)的不同，對光的選擇性吸收也就不一樣。入射光的能量=介質(zhì)中物質(zhì)的基態(tài)和激發(fā)態(tài)能量差溶液的顏色與吸收光顏色的關(guān)系白光(紅、青；橙、青藍；黃、藍；綠、紫；

)物質(zhì)吸收光能的多少與什么有關(guān)系？用眼睛觀察、比較溶液顏色深度以大致估計物質(zhì)含量的方法稱為目視比色法。利用物質(zhì)能吸收光能的原理以精確測定物質(zhì)含量的方法——分光光度法Cu2＋二)分光光度法的概念及原理1.分光光度法的概念

當光線通過透明溶液介質(zhì)時，其輻射能量有部分被吸收而部分被透過，所以光線射出溶液介質(zhì)后光能被減少。這種利用光能的吸收和透過比例來進行某些物質(zhì)的定性定量分析。

1.靈敏度高

分光光度法測定物質(zhì)的濃度下限(最低濃度)一般可達1-10-3%的微量組分。2.分光光度法的特點2.準確度較高

一般分光光度法的相對誤差為2-5%。3.操作簡便，測定速度快4.應(yīng)用廣泛

幾乎所有的無機離子和有機化合物都可直接或間接地用分光光度法進行測定。入射光I0

吸收Ia

透射It

I0=Ia+It+IrI0=Ia+It1.透光率(T)和吸光度(A)

3.分光光度法的原理透光率(transmittance)

T

=It/I0吸光度(absorbance)A2.Lambert-Beer定律（1）Lambert定律:

（2）Beer定律:

（3）Lambert-Beer定律:K為吸光系數(shù)，對于一定物質(zhì)的溶液K為常數(shù)。A=KLA=KCA=KCLtC一定,A∝LL一定,A∝c三)分光光度計的構(gòu)造及使用

能從含有各種波長的混合光中將每一單色光分離出來并測量其強度的儀器稱為分光光度計。

紫外光分光光度計

可見光分光光度計

紅外光分光光度計

萬用（全波段）分光光度計透射光能722型（觸摸鍵式）722型（旋鈕式）可見光分光光度計：722型（觸摸鍵式）1.開電，預(yù)熱20分鐘；2.調(diào)“λ”——選擇所需波長波長旋鈕

原理：將復(fù)合光色散為不同波長的單色光，然后再讓所需波長的光通過一個很窄的狹縫照射到吸收池上。透射光能光路722型（觸摸鍵式）1.開電，預(yù)熱20分鐘；2.調(diào)“λ”——選擇所需波長3.裝液（2/3）透射光能吸收池：比色皿用于盛放溶液的容器。它是由無色透明、耐腐蝕、化學(xué)性質(zhì)相同、厚度相等的玻璃或石英制成的，按其厚度分為0.5cm，1cm，2cm，3cm和5cm?？梢姽夥止夤舛扔嫛ＡП壬笞贤夤夥止夤舛扔嫛⒈壬髾z測器：檢測器的作用是接受從比色皿發(fā)出的透射光并轉(zhuǎn)換成電信號進行測量。光能電能透射光能透射光能顯示裝置：把放大的信號以吸光度A或透光率T的方式顯示或記錄下來。

分光光度計常用的顯示裝置是檢流計、微安表、數(shù)字顯示記錄儀。透射光能吸收池：比色皿用于盛放溶液的容器。它是由無色透明、耐腐蝕、化學(xué)性質(zhì)相同、厚度相等的玻璃或石英制成的，按其厚度分為0.5cm，1cm，2cm，3cm和5cm?？梢姽夥止夤舛扔嫛ＡП壬笞贤夤夥止夤舛扔嫛⒈壬?22型（觸摸鍵式）1.開電，預(yù)熱20分鐘；2.調(diào)“λ”——選擇所需波長3.裝液（2/3）4.功能鍵置“T”——調(diào)“T”為0（遮光體對準光縫）功能鍵722型（觸摸鍵式）1.開電，預(yù)熱20分鐘；2.調(diào)“λ”——選擇所需波長3.裝液（2/3）4.功能鍵置“T”——調(diào)“T”為0（遮光體對準光縫）5.功能鍵置“T”——調(diào)“T”為100（空白管對準光縫）6.功能鍵置“A”——依次拉動拉桿（聽到“咔”一聲）比色、讀數(shù)并記錄（A值取三位有效數(shù)值）7.洗滌比色皿功能鍵722分光光度計使用注意事項：1.樣品室蓋應(yīng)輕開輕放；2.比色皿拿磨砂面，液體裝入約2/3高度，并用擦鏡紙擦凈外壁，每次用完后自來水沖洗干凈，倒置于濾紙上；3.倒取試劑時不能在儀器表面上方操作，儀器上請勿放任何物品；四）測定物含量的計算標準管法標準曲線法1.標準管法空白管(B)標準管(S)測定管(U)1/20稀釋血清標本（ml）－－1.01/20稀釋標準血清（ml）－1.0－生理鹽水（ml）1.0－－雙縮脲試劑（ml）4.04.04.0參比（空白）溶液blank：參比溶液的作用：扣除一切不來源于目標產(chǎn)物的光吸收。如：消除吸收池、溶劑、試劑、干擾物的影響。StandardsampleUnknownsample

1.標準管法空白管(B)標準管(S)測定管(U)1/20稀釋血清標本（ml）－－1.01/20稀釋標準血清（ml）－1.0－生理鹽水（ml）1.0－－雙縮脲試劑（ml）4.04.04.0As=KsCsLsAu=Ku.Cu.LuAsKsCsLsAuKu.Cu.Lu=As.Cs.AuCu.=2.標準曲線法試管12345濃度（C=μg/ml）1020304050吸光度（A）0.0710.1550.2230.2720.366將AU=0.186代入公式y(tǒng)=139.6x-0.647求得CU=25.3μg/ml二、層析技術(shù)ChromatographyTechniqueContents:一)層析技術(shù)的概念二)層析技術(shù)的原理三)層析技術(shù)的分類四)凝膠層析技術(shù)一）層析技術(shù)的概念利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)差異，使各組分在層析系統(tǒng)中以不同速度移動而達到分離的一種物理分離方法?；旌衔顰BCD二）層析技術(shù)的原理理化性質(zhì)：吸附力、分子形狀、大小、酸堿性或分子極性、分子親和力以及分配系數(shù)。利用混合物中各組分理化性質(zhì)差異進行分離;固定相流動相——固定不動（液/固）——針對固定相（相對運動）（氣/液）推動樣品中各組分通過固定相向前移動層析系統(tǒng)當待分離的混合物隨流動相通過固定相時，由于各組分的理化性質(zhì)存在差異，與兩相發(fā)生相互作用（吸附、溶解、結(jié)合等）的能力不同，在兩相中進行再分配。分部收集流出液，可得到樣品中所含的各單一組分，從而達到將各組分分離的目的。（1）按兩相所處的狀態(tài)分類：三）層析技術(shù)的分類液相色譜

氣相色譜

固定相流動相——固定不動（液/固）——針對固定相（相對運動）（氣/液）層析系統(tǒng)液-固層析液-液層析氣-固層析氣-液層析——高效液相色譜(HPLC)柱層析紙層析薄層層析（2）按操作形式不同分類：吸附層析：利用吸附劑表面對不同組分吸附性能的差異，達到分離鑒定的目的。分配層析：利用不同組分在流動相和固定相之間的

分配系數(shù)（或溶解度）不同，使之分離。離子交換層析：利用不同組分對離子交換劑親和力的不同。凝膠層析：利用某些凝膠對于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。（3）按層析原理分類：四）凝膠層析技術(shù)優(yōu)點：設(shè)備簡單、操作方便、樣品回收率高、實驗重復(fù)性好、特別是不改變樣品生物學(xué)活性等。因此凝膠層析技術(shù)廣泛用于蛋白質(zhì)（包括酶）、核酸、多糖等生物分子的分離純化，同時還應(yīng)用于蛋白質(zhì)分子量的測定、脫鹽、樣品濃縮等。凝膠層析：凝膠顆粒多孔板——凝膠（瓊脂糖/葡聚糖/聚丙烯酰胺）——液體（洗脫液）固定相流動相多聚葡萄糖與環(huán)氧丙烷交聯(lián)原理：混合物中各組分按其分子顆粒大小不同而被分離的技術(shù)。凝膠層析又稱分子篩層析分離鑒定不同分子量大小的蛋白質(zhì)用什么方法？影響凝膠層析效果的因素：

1．層析柱的選擇

層析柱大小主要是根據(jù)樣品量的多少以及對分辨率的要求來進行選擇。一般來講，主要是層析柱的長度對分辨率影響較大，長的層析柱分辨率要比短的高；但層析柱長度不能過長，否則會引起柱子不均一、流速過慢等實驗上的一些困難。層析柱的直徑和長度比一般在1：25～1：100之間。用于分組分離的凝膠柱，如脫鹽柱由于對分辨率要求較低，所以一般比較短。品名干膠顆粒直徑/μm得水值Wf/g.g-1床體積/mL.g-1最適分段分離范圍溶脹所需時間/h最大流體靜力壓/Pa(cmH2O)球蛋白分子質(zhì)量／Da線性葡聚糖分子質(zhì)量/Da20℃lOO℃SephadexG-1O40-1201.0±0.12-370070031>9810(100)SephadexG-1540-1201.5±0.22.5-3.51500150031>9810(100)SephadexG-25粗中粗細超細100-30050-15020-8010-402.5±0.24-61000-5000100-500062>9810(100)SephadexG-50粗中粗細超細100-30050-15020-8010-405.0±0.39-111500-30000500-1000062>9810(100)SephadexG-75中粗超細40-12010-407.5±0.512-153000-700001000-500002434905(50)SephdexG-100中粗超細40-12010-4010±l.015-204000-1500001000-1000004853434(35)SephadexG-150中粗超細40-12010-4015±1.520-305000-4000001000-1500007251472(15)SephadexG-200中粗超細40-12010-4020±2.030-405000-8000001000-20000