中藥復(fù)方的體外抗菌活性研究

中藥復(fù)方的體外抗菌活性研究

現(xiàn)在，人類發(fā)現(xiàn)并描述了7000多種真菌，其中大部分對人類直接或間接有益，但一些真菌可能引起真菌感染。被認(rèn)為是真菌感染的真菌有300多種。隨著廣譜抗生素、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等藥物的廣泛應(yīng)用,器官移植的不斷開展,以及侵襲性治療手段的介入,真菌感染日益多見。現(xiàn)應(yīng)用于臨床上的抗真菌藥物主要有棘白菌素類、多烯類、三唑類等,但抗真菌的西藥大多不可避免的對人體產(chǎn)生一定毒副作用并且與之相伴隨的真菌耐藥性日趨嚴(yán)峻。由于還沒有有效的抗真菌疫苗產(chǎn)生,中藥的毒副作用小、價格相對低廉以及耐藥性較小等優(yōu)點(diǎn)為抗真菌中藥的研究提供了良好的基礎(chǔ)。自上世紀(jì)20年代開始,人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并提取了多種具有抗真菌活性且低毒高效的中草藥,然而關(guān)于中藥復(fù)方的研究較少。經(jīng)過查詢祖國書籍并結(jié)合祖方,本試驗(yàn)選用艾葉、苦參、花椒、蒼耳子、苦楝皮、露蜂房等6味單藥加上丙二醇、月桂氮卓酮、乙醇、冰乙酸組成中藥復(fù)方,觀察該復(fù)方制劑對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、大腸埃希氏菌這3個供試菌種的體外抗菌活性,希望為中藥復(fù)方的抗菌研究提供理論基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1中藥樣品6味中草藥樣品均購于黑龍江濟(jì)世堂中藥有限公司,各中草藥樣品的名稱產(chǎn)地所用部位詳見表1。1.1.2供試菌株及菌株金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)AS1.89、大腸桿菌(Escherichiacoli)AS1.90、啤酒酵母(Saccharomycete)AS2.430、白色念珠菌(CandidaAlbicans)AS2.538,以上4種供試菌均購自中科院微生物所。1.1.3u3000xq-ls-50s池塘精天旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52(上海亞榮生化儀器廠);不銹鋼立式壓力蒸汽滅菌器yxq-ls-50sⅡ(東莞市塘廈宏星儀器廠);電子天平FA2004A(上海精天);生化培養(yǎng)箱LRH-150B(廣東省醫(yī)療器械廠);月桂氮卓酮、冰乙酸、丙二醇、乙醇購自哈爾濱醫(yī)藥公司,所用實(shí)驗(yàn)試劑均為國產(chǎn)分析純。1.2方法1.2.1蒸汽-蒸汽法培養(yǎng)基配方:取蛋白胨10g,枸櫞酸鈉10g,氯化鈉10g,加純化水100mL,待溶解后,加入瓊脂25g,105℃~110℃,加熱15min,靜置1h,濾過,待溫度降置70℃時,加入葡萄糖10g,溶解后在115℃蒸汽高壓滅菌30min,備用。啤酒酵母菌懸液制備:取蛋白胨10g,枸櫞酸鈉10g,氯化鈉10g,加純化水100mL,待溶解后,加入瓊脂25g,105℃~110℃,加熱15min,靜置1h,濾過,待溫度降至70℃時,加入葡萄糖10g,溶解后在115℃蒸汽高壓滅菌30min,備用。1.2.2啤酒酵母菌抑菌圈直徑測定抑菌圈直徑的測定:取直徑90mm,高16.5mm的平皿,分別加入預(yù)熱融化的培養(yǎng)基20mL,放置水平臺上使底層凝固,另取培養(yǎng)基適量加熱50℃,加入啤酒酵母菌,搖勻后,在每個平面加入5mL,使在底層上均勻攤布,作為菌層。放置水平臺上冷卻后,在每1個雙碟中均勻安置2個不銹鋼小管(內(nèi)徑6.0mm、高10.0mm、外徑7.8mm),在每個小管中分別滴加供試液0.2mL,蓋上陶瓦蓋,放置35℃培養(yǎng)36h。取出后,用游標(biāo)卡尺(精度0.2mm),測量抑菌圈直徑并記錄。配方比例見表2。1.2.3抑菌圈直徑的選擇根據(jù)不同配方比例的復(fù)方制劑對啤酒酵母菌的抑菌圈直徑測定結(jié)果,選取抑菌圈直徑最大組作為標(biāo)準(zhǔn)配方。按照配方制取100mL復(fù)方制劑溶液30瓶,送至黑龍江省公共衛(wèi)生檢測檢驗(yàn)中心,檢驗(yàn)中藥復(fù)方制劑對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌的殺菌效果。2結(jié)果與分析2.1正交試驗(yàn)結(jié)果在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取浸泡時間、提取次數(shù)及提取時間、乙醇濃度、靜止時間各因素的最優(yōu)試驗(yàn)范圍,研究按照表3的因素水平表。每批試驗(yàn)藥材為處方中以水提取藥材總量的十分之一量,提取物80℃以下烘干,干浸膏稱重,計(jì)算出膏率以出膏率作為考察指標(biāo),選用L9(34)正交試驗(yàn)安排試驗(yàn),確定中藥復(fù)方的最佳制作工藝,結(jié)果見表4。從表3可見,A2B3C2D1方案較好,即浸泡30min,提取3次,第1次2h,第2次1.5h,第3次1h稠膏加乙醇至50%濃度,靜置36h。雖然提取以3次為好,但提取3次的平均出膏率僅較提取2次(2h、1.5h)和提取2次(1.5h、1h)分別高0.097%和0.037%,而提取時間卻多1h和2h。因此,從經(jīng)濟(jì)成本及操作等方面考慮,權(quán)衡利弊得失,得出花費(fèi)最低組合為A2B2C2D1,即加水浸泡30min,提取2次,第1次2h,第2次1.5h,稠膏加乙醇至50%,靜置36h。2.2中藥復(fù)方制劑對酒綠母菌的抗菌圈直徑的測定不同配方比例的中藥復(fù)方制劑對啤酒酵母菌的抑菌圈直徑見表5。2.3中藥復(fù)方制劑對金盞菌、桿菌和白色昆蟲色念珠菌的殺滅效果實(shí)驗(yàn)2.3.1關(guān)于金色葡萄樹殺死試驗(yàn)的影響的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)中藥復(fù)方對金黃色葡萄球菌殺滅試驗(yàn)效果統(tǒng)計(jì),見表6。2.3.2計(jì)算對桿菌病的消除的影響中藥復(fù)方對大腸桿菌的殺滅試驗(yàn)的效果統(tǒng)計(jì),見表7。2.3.3影響白凈試驗(yàn)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)中藥復(fù)方對白色念珠菌的殺滅試驗(yàn)的效果統(tǒng)計(jì),見表8。3中藥復(fù)方制劑的抗菌效果50%濃度中藥復(fù)方制劑厚液作用2min,對金黃色葡萄球菌的平均殺滅率100%;在溫度19~21℃相對濕度30%的條件下,作用2min,對大腸桿菌的平均殺滅率100%;同樣對白色念珠菌殺滅率100%。說明艾葉、苦參、花椒、蒼耳子、苦楝皮、露蜂房組成的復(fù)方制劑對三種病原菌都有極強(qiáng)的殺菌作用。艾葉內(nèi)含有豐富的黃酮類化合物,具有抗菌、消炎、抗過敏等多種作用。苦參的丙酮提取物可以有效抑制白色念珠菌生長,其抑菌效果與臨床上應(yīng)用的咪唑類抗真菌藥物相似?；ń泛蜕叽沧右?比2的比例配成復(fù)方,對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌以及白色念珠菌都有很強(qiáng)的抑菌效果,并且陰道膜刺激實(shí)驗(yàn)為陰性,證明該配方的體內(nèi)抗菌性良好并且副作用少。有研究發(fā)現(xiàn),蒼耳子內(nèi)含的蒼耳素對金黃色葡萄球菌有強(qiáng)大的抑菌效果,并且還對耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌有良好的抑菌效果。OrhanIE等發(fā)現(xiàn)苦楝皮對格蘭陰性細(xì)菌和白色念珠菌有較強(qiáng)的抑菌效果,這可能和苦楝皮內(nèi)豐富的黃酮類物質(zhì)有關(guān)。露蜂房具有抗病毒、抗炎、抗菌等作用,還有實(shí)驗(yàn)證明露蜂房對變形鏈球菌有較強(qiáng)的抑菌能力,這對齲齒的預(yù)防和治療有著重要意義。本實(shí)驗(yàn)采用的6味單藥都具有一定的體外抗菌活性。中草藥對真菌的作用機(jī)制主要在于破壞其細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的完整,或影響其核酸、脂質(zhì)代謝等方面。中草藥內(nèi)含有大量具有抗菌活性的物質(zhì),主要活性成分可分為黃酮類、生物堿類、脂肪酸類、皂苷類和揮發(fā)油類化合物等。中藥復(fù)方制劑不僅可以通過抗菌物質(zhì)的直接作用產(chǎn)生抗菌作用,還有實(shí)驗(yàn)顯示中藥復(fù)方可以通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力產(chǎn)生抗真菌作用。劉春英等發(fā)現(xiàn),補(bǔ)中益氣湯是良好的免疫激活劑,能顯著提高抗體水平及細(xì)胞免疫功能。在免疫功能下降的白色念珠菌感染動物模型中,抗真菌藥物與補(bǔ)中益氣湯配伍用的小鼠存活率顯著高于單獨(dú)使用抗真菌藥物組,補(bǔ)中益氣湯并無直接抗真菌