中國黃酒麥曲香氣成分的定性與分析

中國黃酒麥曲香氣成分的定性與分析

小麥法和小麥法是中國黃酒的制備工藝的特點。人們普遍認為，被稱為“酒之骨”的麥曲是黃酒釀造的動力，具有“糖化、發(fā)酵、生香”功能，對黃酒釀造起著舉足輕重的作用。但是，對于麥曲的理解和研究還停留在簡單的生物學作用上，僅僅以糖化力、液化力和發(fā)酵力作為評價麥曲質量優(yōu)劣的指標。隨著黃酒釀造科學的發(fā)展，黃酒的生產(chǎn)科研人員雖然已經(jīng)認識到黃酒麥曲對黃酒風味的重要性，但是受到研究理念和技術的限制，對于非常重要的麥曲“生香功能”涉及極少，只停留在推測和分析上。在過去對黃酒麥曲的研究中，并沒有系統(tǒng)地研究麥曲風味特征，更沒有用現(xiàn)代風味化學手段對麥曲風味物質進行科學的研究。麥曲賦予黃酒的“生香功能”，不僅在于能給黃酒提供生成香味成分的酶及風味前驅物質，更重要的是本身也含有豐富的香氣物質，是黃酒風味的直接給予者。因此，要了解黃酒麥曲對黃酒風味的作用，首先得用現(xiàn)代風味化學手段，來了解黃酒麥曲中主要香氣化合物的種類和含量及有重要貢獻的香氣化合物。日本清酒米曲對清酒的作用和中國黃酒麥曲對黃酒的作用非常相似。高橋美繪等用頂空吸附萃取技術對日本清酒米曲中的香氣物質進行了研究。共鑒定出11種香氣化合物，并且發(fā)現(xiàn)1-辛烯-3-酮、3-甲硫基丙醛、2-甲基-2-庚烯-6-酮、苯乙醛、1-辛烯-3-醇是米曲的重要香氣物質。雖然日本清酒米曲中香氣物質的研究對我國黃酒麥曲香氣研究有重要的參考意義，但是日本清酒米曲是由純種培養(yǎng)的米曲霉發(fā)酵制成，曲菌較單一，其代謝產(chǎn)物也較為簡單，鑒定出的風味物質也很少，因而對黃酒的借鑒作用有限。黃酒麥曲微生物菌群復雜，隨之產(chǎn)生的風味物質也很豐富，分析其中的香氣物質存在一定的困難，有必要尋找更好的方法來研究其中的香氣物質。黃酒麥曲中究竟含有何種香氣物質、含量多少、有多大貢獻、用何種技術、方法和手段來分析，目前還是個盲點。黃酒麥曲揮發(fā)性香氣成分含量甚微，要檢測其中的揮發(fā)性香氣化合物，首先得對樣品進行濃縮預處理。常見的濃縮預處理方有液-液萃取法、蒸餾法、固相萃取法、固相微萃取(SPME)法等。其中SPME法具有操作簡單、快速、靈敏度高、選擇性好、樣品量少、無需溶劑的優(yōu)點。近些年來，SPME法在食品行業(yè)有著廣泛的應用，如在食醋、蘋果酒、白酒中香氣物質分析方面的成功應用。隨著食品風味分析的發(fā)展，SPME法在中國黃酒風味物質方面的分析，也得到了令人滿意的結果，如陸燕等用頂空固相微萃取法(HS-SPME)對用傳統(tǒng)法和糯米膨化法釀造的黃酒風味物質進行的分析檢測，羅濤等用頂空固相微萃取法對黃酒中的揮發(fā)性和半揮發(fā)性微量成分進行了分析研究，鑒定出的揮發(fā)性和半揮發(fā)性微量成分有97種。故研究選擇頂空固相微萃取法來分析黃酒麥曲中香氣物質。對黃酒麥曲中的香氣物質進行定性分析，首先必須準確鑒定出黃酒中的香氣物質的種類。目前國內對食品中香氣物質的定性一般直接采用氣質聯(lián)用法(GC-MS)分析。而GC-MS只能初步嘗試性地鑒定其中的微量成分，并不能有效地、準確地鑒定出樣品中香氣活性物質。氣相色譜-嗅聞法(GC-O)是解決這一問題的理想方法，該技術是目前國際上最為先進的、可以將氣味檢測儀與氣相色譜儀結合的一種風味化合物分析技術。不僅如此，采用氣相色譜-嗅聞法中的香氣強度法（GC-Osme）還能幫助初步推斷樣品中有重要貢獻的香氣化合物。近年來，氣相色譜-嗅聞法在國外的應用已得到了蓬勃發(fā)展，如在葡萄酒、干酪等食品風味分析方面的應用。因而研究采用GC-Osme法，結合氣質聯(lián)用(GC-MS)法來定性分析黃酒麥曲中的香氣物質。要準確得知黃酒麥曲中香氣物質的含量需要對其進行定量分析。而定量分析得出的香氣物質濃度只能給出其在黃酒麥曲中的具體含量，并不能準確反映其在黃酒麥曲中的香氣貢獻及貢獻程度，香氣活力值（OAV）可以達到這種目的。香氣活力值是指香氣化合物的濃度和香氣閾值之比，香氣閾值是指嗅覺器官所感覺到的香氣化合物氣味時的最低濃度。只有那些含量超過其香氣閾值的化合物才有香氣貢獻，并且香氣活力值大的香氣化合物其香氣貢獻亦大。因而本研究采用香氣活力值法來準確分析黃酒麥曲中有重要貢獻的香氣物質。本研究采用頂空固相微萃取法(HS-SPME)、氣質聯(lián)用(GC-MS)法、GC-O香氣強度法及香氣活力值（OAV）法對中國黃酒麥曲中的香氣成分進行定性定量分析，對黃酒麥曲中主要香氣化合物的種類和含量及有重要貢獻的香氣化合物進行較全面的研究。以拓展到對黃酒麥曲中香氣物質的形成機理、黃酒麥曲曲香與黃酒風格相關組分關系的研究，以豐富黃酒的釀造科學與理論，以期應用于黃酒業(yè)黃酒風味的調控和黃酒質量的提高。1材料和方法1.1標樣、無水乙醇黃酒麥曲：均由江、浙、滬、魯黃酒廠提供。氯化鈉和氯化鈣均為分析純：購自中國醫(yī)藥(集團)上海化學試劑公司；其余標樣、無水乙醇均為色譜純。2-辛醇(96%)和2-苯乙醇(99%)：購自Fluka公司(SigmaAldrich,China)；辛酸(98%)；購自吳江慈云香料香精有限公司；己醛(98%)：購自北京北大正元科技有限公司；其他(純度均>98%)均購自Sigma-Aldrich(中國)公司。1.2方法1.2.1標準溶液的配制準確稱取一定量標準品配制到無水乙醇中，再稀釋制成一系列濃度的標準溶液。內標混合溶液：2-辛醇和4-(4-甲氧苯基)-2-丁酮的無水乙醇溶液。1.2.2化合物的測定采用HS-SPME和GC-MS分析麥曲中的揮發(fā)性香氣化合物，按參考文獻的方法。GC-MS分析：安捷倫公司6890NGC和5975MS。進樣口和檢測器溫度均為250℃，He為載氣，流速為2mL/min。毛細管色譜柱為FFAP(60m×0.25mm×0.25μm)。程序升溫：50℃恒溫2min，以6℃/min的速度升溫至230℃，保持15min。EI電離源，溫度為230℃，電子能量70eV。物質的定性分析：是將未知物的圖譜與NIST05a.LDatabase(AgilentTechnologiesInc.)中標準譜圖進行比對，結合物質香氣，并與標準物的保留時間、香氣進行對比驗證，確定所檢出的化合物。物質的定量分析：采用國際上流行的內標標準加入法，即每個香氣化合物分別對應于內標做標準曲線。經(jīng)過GC–MS檢測后利用待測物質和內標的相對峰面積比代入相對應的標準曲線方程計算出待測物質在麥曲中的含量。香氣活力值(OAV)：香氣活力值是香氣化合物的濃度與該香氣化合物的香氣閾值濃度（在水中的濃度）之比。2結果和分析2.1揮發(fā)性香氣化合物黃酒麥曲成分復雜，用HS-SPME和GC-MS能夠檢測到很多種揮發(fā)性微量成分經(jīng)，附圖為HS-SPME檢測的所得GC-MS總離子流譜圖。但是，不是所有的揮發(fā)性物質都能呈現(xiàn)香氣，因此結合GC-O香氣強度法分析，確定了黃酒麥曲中有香氣特征的揮發(fā)性香氣化合物。黃酒麥曲中揮發(fā)性香氣化合物的定性檢測結果見附表。共鑒定出了42種揮發(fā)性香氣化合物，其包括2種醛類化合物、3種酮類化合物、11種醇類化合物、3種酯類化合物、5種酸類化合物、5種芳香族化合物、1種呋喃類化合物、1種含硫化合物、1種內酯類化合物、5種酚類化合物、5種含氮化合物。其中，香氣最強的物質有1-辛烯-3-酮（蘑菇香）、1-辛烯-3-醇（蘑菇香）、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚（辛辣味，丁香）等。香氣強的物質有己醛（青草香，蘋果香）、己酸乙酯（水果香，花香，甜香）、辛酸乙酯（水果香）、苯乙醛（玫瑰花香，蜂蜜香）、愈創(chuàng)木酚（辛辣氣味，丁香，煙熏氣味）、香蘭素（香草香）等?？梢猿醪酵茢噙@些化合物對黃酒麥曲的生香功能起著重要的作用。黃酒麥曲中有著如此多的香氣成分，也證明了其生香功能對黃酒風味貢獻的重要性。2.2分離出合理的香氣化合物對已定性的42種揮發(fā)性香氣化合物進行了定量分析。根據(jù)標準曲線計算得到了在黃酒麥曲中的準確含量。附表也列出了黃酒麥曲中揮發(fā)性香氣化合物含量情況。在所定量的化合物中，含量居前三位的化合物依次是乙酸乙酯（11831.39μg/kg）、異戊醇（3158.62μg/kg）、苯乙醇（2410.32μg/kg）。預計這3種化合物對構成黃酒麥曲整體香氣的基本骨架有比較重要的影響。從附表可以看出，酯類、醇類、酸類、酚類及其衍生物含量較豐富，推測對黃酒麥曲的整體風味有較大影響。但化合物含量高并不意味著對黃酒麥曲的貢獻就大，需要結合對應的閾值才能間接判定其在黃酒麥曲中的重要性。查閱相關文獻，得到42種揮發(fā)性香氣化合物在水中的香氣閾值，根據(jù)濃度和香氣閾值之比，計算出了香氣化合物在黃酒麥曲中的OAV值。結果表明（見附表）：麥曲的揮發(fā)性香氣化合物中有18種化合物的濃度高于其香氣閾值，說明這18種化合物對黃酒麥曲都有一定的香氣貢獻。其中OAV值在1～5的香氣化合物有2-庚酮、2-辛酮、3-辛醇、乙酸乙酯、苯乙醇、4-甲基苯酚。這些化合物對黃酒麥曲的曲香都有不同程度的貢獻。OAV值在5～10的香氣化合物有異戊醇、庚醇、苯并噻唑、γ-壬內酯。這些化合物對黃酒麥曲的曲香都有較大的貢獻。OAV值大于10的香氣化合物有1-辛烯-3-酮（OAV=618.11）、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚（OAV=386.01）、1-辛烯-3-醇（OAV=291.45）、己酸乙酯（OAV=142.13）、己醛（OAV=109.18）、辛酸乙酯（OAV=51.36）、愈創(chuàng)木酚（OAV=21.29）、苯乙醛（OAV=13.36）。故可以推斷，這些化合物對黃酒麥曲有重要貢獻，是黃酒麥曲中最重要的特征香氣化合物。通常，香氣強度大的物質同時亦具有較大的OAV值。如1-辛烯-3-酮、1-辛烯-3-醇、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、己醛、己酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙醛、愈創(chuàng)木酚等香氣強度大的物質，其OAV值也大。但實際結果表明，也有例外，一些香氣強度大的物質，卻含量甚微，甚至未被定量測出，如香蘭素。分析原因是由于香蘭素的香氣閾值極低，因此香氣強，但其濃度卻極低，低于標準曲線下限，因而未被定量出。根據(jù)香氣強度和OAV值結果可以斷定：1-辛烯-3-酮、1-辛烯-3-醇、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、己醛、己酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙醛、愈創(chuàng)木酚等這些化合物是黃酒麥曲中重要的香氣化合物，對黃酒麥曲香氣貢獻非常大。1-辛烯-3-酮和1-辛烯-3-醇在黃酒麥曲中香氣強度大、OAV值高，是黃酒麥曲中最重要的香氣物質，它們在日本米曲中也很重要。其中1-辛烯-3-醇來源于微生物產(chǎn)生的磷脂β-氧化反應，其前驅物質是亞油酸，而1-辛烯-3-酮則是由1-辛烯-3-醇通過酶的氧化作用而形成的。日本清酒米曲的香氣物質研究中，發(fā)現(xiàn)在米曲的制作過程中，隨著發(fā)酵的進行，微生物菌體不斷繁殖生長，亞油酸的濃度也不斷增加，1-辛烯-3-醇含量也增加，他們推斷在制曲過程中，亞油酸可作為菌體生長的一個指標。為此我們也可以在黃酒麥曲的制曲過程中，根據(jù)香氣物質1-辛烯-3-醇的含量來判斷黃酒麥曲的發(fā)酵情況，因此香氣物質的含量可以作為判斷麥曲發(fā)酵好壞的重要信息源。另外，己醛也是黃酒麥曲中重要的香氣物質，賦予麥曲以優(yōu)雅的青草香氣，己醛也來源于磷脂β-氧化反應，前驅物質是亞油酸。4-乙烯基愈創(chuàng)木酚和愈創(chuàng)木酚是黃酒麥曲中另一類重要香氣物質，賦予麥曲辛辣味、煙熏氣味、丁香、中藥氣味。4-乙烯基愈創(chuàng)木酚在黃酒麥曲中香氣強度大，OAV值也高，主要來源于微生物發(fā)酵中阿魏酸的脫羧反應，此反應的微生物主要有霉菌（如白腐菌，黑曲霉和青霉菌等）、酵母（如釀酒酵母、漢遜氏酵母、假氏酵母等）、某些細菌（如枯草芽胞桿菌、短小芽胞桿菌、植物乳桿菌、和熒光假單胞桿菌等）和放線菌如鏈霉菌等。阿魏酸在糧谷類含量豐富，在小麥中含量為0.05g/kg～0.5g/kg。以阿魏酸為前驅物質，由微生物代謝，可以產(chǎn)生一系列的揮發(fā)性酚類化合物，除產(chǎn)生4-乙烯基愈創(chuàng)木酚外，還產(chǎn)生愈創(chuàng)木酚、香蘭素、4-乙基愈創(chuàng)木酚等。香蘭素呈現(xiàn)令人愉快的香草香，其含量甚微，但閾值低，故在GC-O聞香中檢測其香氣強。己酸乙酯和辛酸乙酯表現(xiàn)為水果香、甜香和花香，它們也是黃酒麥曲中重要的香氣化合物，給麥曲以令人愉快的香氣。酯類物質來源于醇和酸的酯化反應，也可以來源于微生物的醇?；D移酶和醇的縮合反應。因此它們的形成和微生物發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乙酰輔酶A有關。苯乙醛是清酒米曲中重要的香氣化合物，在中國黃酒麥曲中也非常重要。苯乙醛賦予黃酒麥曲令人愉悅的、柔和的玫瑰花香、蜂蜜香，主要來源于微生物氨基酸代謝，其前驅物質是苯丙氨酸。3酒精麥曲中主成分的檢測研究運用頂空固相微萃取法(HS–SPME)、氣質聯(lián)用法(GC-MS)、GC-O香氣強度法及香氣活力值（OAV）法的新技術和手段，全面剖析了黃酒麥曲中的香氣物質，為黃酒麥曲的風味分析提供了思路和技術。研究采