基于snp標(biāo)記的荷斯坦牛群親子推斷研究

基于snp標(biāo)記的荷斯坦牛群親子推斷研究

家譜信息在牛育種中起著重要作用。錯(cuò)誤的系譜會(huì)大大降低遺傳評(píng)定準(zhǔn)確性,影響選種選配的效果,降低群體的遺傳進(jìn)展,給奶牛生產(chǎn)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)影響。然而,在實(shí)際養(yǎng)殖生產(chǎn)中,系譜記錄錯(cuò)誤是難免的,它受多種因素影響,如配種記錄、產(chǎn)犢記錄、系譜錄入及整理中的人為錯(cuò)誤等等,尤其在飼養(yǎng)管理較粗放的散養(yǎng)式牧場(chǎng),犢牛出生后很難確定父親甚至雙親,往往會(huì)造成系譜錯(cuò)誤。世界范圍平均的奶牛系譜錯(cuò)誤率約為11%。汪湛等報(bào)道了天津部分奶牛場(chǎng)的系譜錯(cuò)誤率為11.83%,初芹等利用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)北京地區(qū)21個(gè)場(chǎng)的系譜錯(cuò)誤率進(jìn)行檢測(cè),平均為16.3%。進(jìn)入21世紀(jì)后,隨著SNP標(biāo)記檢測(cè)手段的不斷成熟,利用SNP標(biāo)記進(jìn)行牛的親子推斷成為可能,Heaton和Werner等也分別報(bào)道了用32~37個(gè)SNPs標(biāo)記在肉牛、奶牛的多品種群中進(jìn)行親子推斷的結(jié)果。2009年Fisher等人的研究表明利用一定數(shù)目的SNPs標(biāo)記進(jìn)行奶牛親子鑒定可以達(dá)到或超過(guò)目前所常用的微衛(wèi)星標(biāo)記體系的效率。目前我國(guó)尚無(wú)利用SNP標(biāo)記進(jìn)行實(shí)際奶牛群體親子推斷的研究。本研究利用北京地區(qū)中國(guó)荷斯坦?；蚪M選擇資源群體的SNP標(biāo)記基因型信息,研究其親子推斷的效率,并分析系譜錯(cuò)誤率的影響因素,以期為降低系譜錯(cuò)誤,改善牛場(chǎng)生產(chǎn)管理,加快我國(guó)奶牛育種進(jìn)程提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1篩選合適的品種研究群體為北京地區(qū)的中國(guó)荷斯坦牛,包括13頭種公牛及其1927頭女兒,其中2頭種公牛為同卵雙生且基因型完全相同,合并處理;另外隨機(jī)選擇了71頭荷斯坦青年公牛同時(shí)作為候選公牛。公牛女兒分布于北京地區(qū)15個(gè)牛場(chǎng),系譜信息由中國(guó)奶業(yè)協(xié)會(huì)數(shù)據(jù)處理中心提供。1.2測(cè)標(biāo)記基因型的構(gòu)建使用DP318基因組提取試劑盒(天根,北京)從母牛凝血和公牛凍精中提取基因組DNA。檢測(cè)DNA濃度后全部定量到10ng·μL-1。使用IlluminaBovineSNP50芯片檢測(cè)標(biāo)記基因型,由IlluminaBovineSNP50Beadchip儀器完成,每個(gè)芯片含有54001個(gè)SNPs。用于親子推斷的SNP標(biāo)記的篩選標(biāo)準(zhǔn)參照美國(guó)農(nóng)業(yè)部的研究(/USDA/index.html):1)最小等位基因頻率(MAF)大于0.45;2)每個(gè)標(biāo)記的檢出率(Callrate)大于0.95;3)每條染色體上相鄰SNPs間距大于10Mb。美國(guó)農(nóng)業(yè)部推薦121個(gè)SNPs標(biāo)記進(jìn)行親子鑒定,其中有112個(gè)標(biāo)記在本研究的芯片中,而本研究所選的255個(gè)標(biāo)記與美國(guó)推薦的標(biāo)記沒(méi)有直接關(guān)系。1.3不同狀況的真實(shí)父母是否成為選型錯(cuò)誤親子推斷采用Cervus3.0軟件,以84頭公牛作為候選親本,利用最大似然原理對(duì)母牛群體進(jìn)行親本推斷。Cervus軟件針對(duì)每頭母牛,對(duì)提供的所有候選親本進(jìn)行計(jì)算,并給出似然得分最高的親本。本研究中,當(dāng)軟件推斷出的父親與后代的似然得分大于零時(shí),就認(rèn)為該公牛是真實(shí)父親,似然得分越高,可靠性越高;如果推斷的母牛真實(shí)父親與實(shí)際系譜記錄不一致,則認(rèn)為其為系譜錯(cuò)誤。當(dāng)軟件推斷出的父親與后代的似然得分小于零時(shí),認(rèn)為它不是真實(shí)父親,即該后代的真實(shí)父親不在候選親本中,也作為系譜錯(cuò)誤處理。這兩部分的系譜錯(cuò)誤合并為總的系譜錯(cuò)誤率。1.4其他明顯的群體效應(yīng)采用以下統(tǒng)計(jì)模型對(duì)影響系譜錯(cuò)誤的因素進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析:y=μ+sire+herd+year+month+e其中,y表示系譜是否錯(cuò)誤,錯(cuò)誤用1表示,否則用0;μ是群體總平均值;sire為公牛家系效應(yīng);herd為場(chǎng)效應(yīng);year為母牛出生年份效應(yīng);month為母牛出生月份效應(yīng);e為隨機(jī)殘差效應(yīng)。統(tǒng)計(jì)分析采用SAS9.2GLM軟件包來(lái)完成。2結(jié)果2.1snps標(biāo)記的分布本研究從IlluminaBovine50SNP芯片數(shù)據(jù)結(jié)果中共篩選出255個(gè)高多態(tài)性SNPs標(biāo)記,這些標(biāo)記分布于29條常染色體上,平均間距為10.62Mb,具體的分布情況如圖1所示。其中,1號(hào)染色體上標(biāo)記數(shù)最多,共16個(gè),平均間隔為10.53Mb。篩選出的標(biāo)記最小等位基因頻率均高于0.45,檢出率高于0.95,適合用于進(jìn)行親子推斷。2.2真實(shí)父母與非真實(shí)高校使用255個(gè)SNPs標(biāo)記,將84頭公牛作為候選親本,對(duì)1927頭母牛進(jìn)行了親子推斷研究,其中1847頭(95.8%)母牛被推斷出的最可能父親的似然得分大于零且推斷父親的置信度均達(dá)到95%以上;有402頭母牛存在系譜錯(cuò)誤,其中80頭(4.1%)的pairLOD值小于0,可認(rèn)為沒(méi)有推斷出父親,即真實(shí)父親不在84頭公牛內(nèi);其余的322頭推斷出了父親,其中196頭(占322頭的60.9%)的真實(shí)父親在13頭公牛中,126頭(占322頭的39.1%)的真實(shí)父親在其余71頭公牛中。1847頭母牛的最可能父親的似然得分的分布情況如圖2。可見(jiàn)似然得分多在30~50之間,即這些母牛推斷的父親可信度很高。理論上,真實(shí)親本與其后代的基因型之間不應(yīng)存在孟德?tīng)柮?但這1847頭母牛中仍有少數(shù)個(gè)體(4%比例)的基因型與其推斷的最可能父親基因型之間存在孟德?tīng)柮?表1)。然而,這些親子對(duì)中存在孟德?tīng)柮艿臉?biāo)記數(shù)均很少,最多僅為4個(gè)。造成這種現(xiàn)象的最可能原因是標(biāo)記判型錯(cuò)誤。根據(jù)255個(gè)SNPs標(biāo)記的親子推斷結(jié)果,1927頭母牛中有80頭母牛未推斷出真實(shí)父親,323頭母牛推斷的真實(shí)父親與系譜記錄不一致,即403頭母牛的公牛系譜是錯(cuò)誤的,平均系譜錯(cuò)誤率為20.9%。2.3不同牛場(chǎng)的譜系錯(cuò)誤情況系譜錯(cuò)誤的產(chǎn)生受多種因素影響。在本研究中,考慮了母牛所在場(chǎng)、出生年份、出生月份及公牛家系對(duì)系譜錯(cuò)誤的影響,結(jié)果顯示公牛間差異不顯著(P>0.05),不同場(chǎng)間系譜錯(cuò)誤率有極顯著差異(P<0.001),母牛出生年份和出生月份間的系譜錯(cuò)誤率差異顯著(P<0.05),具體見(jiàn)表2。對(duì)各牛場(chǎng)的系譜錯(cuò)誤情況分別進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)(表3),可見(jiàn)不同牛場(chǎng)間系譜錯(cuò)誤率差別非常大,系譜錯(cuò)誤率最低的牛場(chǎng)其錯(cuò)誤率僅為6.9%,而系譜錯(cuò)誤率最高的牛場(chǎng)其錯(cuò)誤率高達(dá)46.3%。15個(gè)牛場(chǎng)中有8個(gè)牛場(chǎng)的系譜錯(cuò)誤率都在20%以上。系譜錯(cuò)誤比例=系譜錯(cuò)誤母牛數(shù)/檢測(cè)母牛數(shù)Pedigreeerrorrate=Numberofcowswithrejectedpaternity/Numberofcowsdetected不同年份出生母牛的系譜錯(cuò)誤率差異也非常大,2002年系譜錯(cuò)誤率最低,為16.85%,2006年最高,為27.84%。2001-2006年,平均系譜錯(cuò)誤率波動(dòng)很大,但總體呈上升趨勢(shì),為22.39%~27.8%(圖3)。從母牛出生月份角度來(lái)看,1月和10~12月份系譜錯(cuò)誤率較低,平均為18.74%,9月份系譜錯(cuò)誤率最高,達(dá)到28.82%,而其它月份系譜錯(cuò)誤率較平穩(wěn),在23.19%~26.89%之間(圖4)。3討論3.1不同牛場(chǎng)間的譜系錯(cuò)誤率差異較本研究中,北京地區(qū)的荷斯坦母牛的系譜錯(cuò)誤率平均為20.9%,高于汪湛和初芹等報(bào)道的錯(cuò)誤率數(shù)據(jù)。一方面是由于本研究使用的SNPs標(biāo)記數(shù)目多,分布廣,具有更高的推斷效率,如周磊的模擬研究發(fā)現(xiàn),利用SNP標(biāo)記進(jìn)行親子鑒定,在最小等位基因頻率為0.35~0.50時(shí),以至少2個(gè)矛盾排除原則推斷需要54個(gè)SNPs,本研究共挑選了255個(gè)間距大、分布均勻、MAF高的標(biāo)記,達(dá)到了很高的推斷水平。而另一方面也可能是由于研究群體本身之間系譜錯(cuò)誤情況就存在差異造成的。在影響系譜錯(cuò)誤率的諸多因素中,牛場(chǎng)是主要因素,不同牛場(chǎng)間系譜錯(cuò)誤率差異較大,最高牛場(chǎng)系譜錯(cuò)誤率約是最低牛場(chǎng)系譜錯(cuò)誤率的7倍,顯示出不同牛場(chǎng)的管理水平及對(duì)系譜登記工作的重視程度和對(duì)分娩牛監(jiān)督管理水平的差異。實(shí)際生產(chǎn)中有多種因素可造成系譜登記錯(cuò)誤。例如,奶牛多在夜間分娩,如果接生人員沒(méi)有及時(shí)監(jiān)護(hù),可能造成幾個(gè)犢牛同晚出生而分不清母親,進(jìn)而導(dǎo)致?tīng)倥８赣H的記錄錯(cuò)誤;實(shí)際生產(chǎn)中牛耳標(biāo)遺失后會(huì)根據(jù)譜系中犢牛的花片來(lái)確認(rèn)牛只,往往也會(huì)造成一定的錯(cuò)誤。此外,如果牛場(chǎng)的考核指標(biāo)存在缺陷,也可能間接造成人為的系譜記錄錯(cuò)誤,如有的牛場(chǎng)將犢牛死淘率作為考核指標(biāo),可能用雙胎個(gè)體中的一頭去取代死胎而導(dǎo)致人為的系譜錯(cuò)誤。分析結(jié)果顯示,不同母牛出生年份和月份間系譜錯(cuò)誤率存在顯著差異。2001-2006年,北京地區(qū)牛場(chǎng)的系譜錯(cuò)誤率有增加趨勢(shì),從22.3%升高到27.8%,造成這種現(xiàn)象的原因可能是由于奶牛存欄數(shù)量逐年增加,牛場(chǎng)規(guī)模不斷擴(kuò)大增加了管理難度造成的。1年的12個(gè)月份中,9月份出生母牛系譜錯(cuò)誤率最高,而1月份和10~12月份的系譜錯(cuò)誤率較低,這與北京地區(qū)奶牛的產(chǎn)犢季節(jié)性有關(guān)。在實(shí)際生產(chǎn)中,9月份是大多數(shù)牛場(chǎng)的產(chǎn)犢高峰期,產(chǎn)犢數(shù)量激增造成牛場(chǎng)值班人員工作量增加,管理難度加大,系譜錯(cuò)誤率上升;而每年的1~3月份發(fā)情牛只較少,因此10月份到次年1月份的產(chǎn)犢數(shù)量較少,系譜錯(cuò)誤率也相對(duì)較低。此外,公牛對(duì)系譜錯(cuò)誤率并沒(méi)有顯著影響,說(shuō)明系譜錯(cuò)誤主要是牛場(chǎng)本身的管理因素造成的,而非遺傳因素。因此,在中國(guó)亟待采取一系列措施提高牧場(chǎng)管理水平,加強(qiáng)繁殖監(jiān)管,完善系譜記錄制度,進(jìn)而提高系譜準(zhǔn)確性。3.2基于群體隨機(jī)抽樣檢測(cè)的遺傳檢測(cè)Weller等提出,如果保證每年牛群的遺傳進(jìn)展在1%以上,那么系譜錯(cuò)誤率需控制在8%以下。此外,據(jù)模擬研究結(jié)果,如果美國(guó)奶牛遺傳評(píng)估中母牛的父親記錄錯(cuò)誤率為11%,群體遺傳進(jìn)展將會(huì)降低11%~15%。根據(jù)Visscher等提出的系譜錯(cuò)誤造成的選擇進(jìn)展損失公式,本研究中一半的牛場(chǎng)系譜錯(cuò)誤率都在20%以上,如果假設(shè)選擇性狀遺傳力為0.25,每頭公牛女兒數(shù)為50,那么選擇進(jìn)展的損失率約為12%。為了降低系譜錯(cuò)誤對(duì)生產(chǎn)和育種帶來(lái)的不利影響,各奶業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家早已建立了系譜錯(cuò)誤檢測(cè)、校正的監(jiān)管系統(tǒng),利用遺傳標(biāo)記進(jìn)行群體隨機(jī)抽樣的親子鑒定。例如,澳大利亞荷斯坦協(xié)會(huì),在全國(guó)每500頭登記出生的犢牛中就抽檢1頭,要求農(nóng)戶將犢牛及其母親的毛囊樣品寄到協(xié)會(huì),由協(xié)會(huì)出資進(jìn)行親子鑒定。在我國(guó)奶牛業(yè)迅猛發(fā)展的現(xiàn)階段,已成熟的標(biāo)記檢測(cè)方法,包括微衛(wèi)星標(biāo)記和SNP標(biāo)記,建立系譜準(zhǔn)確性的監(jiān)管體系已經(jīng)迫在眉睫,以監(jiān)督后裔測(cè)定系統(tǒng)的正確性和準(zhǔn)確性為出發(fā)點(diǎn),進(jìn)而加強(qiáng)記錄管理意識(shí)和手段指導(dǎo)生產(chǎn),可加速中國(guó)奶牛群體遺傳進(jìn)展。這也是今后我國(guó)奶牛遺傳改良的重要基礎(chǔ)工作之一。3.3基因型判定錯(cuò)誤隨著芯片技術(shù)的不斷發(fā)展,SNP標(biāo)記應(yīng)用越來(lái)越廣泛,SNP標(biāo)記具有自動(dòng)化檢測(cè)程度高,基因型判定錯(cuò)誤率低,突變率低,基因組分布廣泛等優(yōu)點(diǎn),其缺點(diǎn)是單個(gè)標(biāo)記多態(tài)性低,需要標(biāo)記數(shù)多,但芯片技術(shù)給SNP的應(yīng)用創(chuàng)造了有利條件。微衛(wèi)星具有單個(gè)標(biāo)記多態(tài)性高,需要標(biāo)記數(shù)少的優(yōu)點(diǎn),但存在基因型判定錯(cuò)誤率高的缺陷,而基因型判定錯(cuò)誤對(duì)親子鑒定的準(zhǔn)確性影響很大。因此,SNP在親子推斷上具有更大的應(yīng)用前景。4場(chǎng)、牛場(chǎng)管理情況的估計(jì)本研究利用255個(gè)高多態(tài)性SNPs標(biāo)記實(shí)現(xiàn)了對(duì)中國(guó)荷斯坦牛親子關(guān)系的高效推斷。以分布于15個(gè)牛場(chǎng)的1927頭北京地區(qū)中國(guó)荷斯坦母牛為試驗(yàn)對(duì)象,平均系譜錯(cuò)誤率估