山楂麥曲顆粒和大山楂顆粒中展青霉素的分子印跡固相萃取-高效液相色譜測(cè)定方法研究

山楂麥曲顆粒和大山楂顆粒中展青霉素的分子印跡固相萃取-高效液相色譜測(cè)定方法研究

青霉是青霉、生長(zhǎng)青霉和圓形青霉的二次代謝物。它是一種遺傳毒性藥物，具有畸形、致癌性和革蘭氏性。由于展青霉素對(duì)人類可能造成的危害,世界上許多國(guó)家都規(guī)定了食品中展青霉素的限量值,我國(guó)國(guó)標(biāo)GB2761-2011《食品中真菌毒素限量》中規(guī)定展青霉素的限量為50μg/kg。展青霉素主要存在酸性果實(shí)中,在蘋果、山楂及其制品中檢出較多。中藥及中成藥中亦有許多酸性果實(shí)類藥材入藥,但目前展青霉素檢測(cè)研究報(bào)道多集中于果實(shí)類食品而關(guān)于中藥相應(yīng)檢測(cè)方法報(bào)道較少。山楂麥曲顆粒和大山楂顆粒的主要原料均為山楂、麥芽及六神曲,這些中藥材有可能受到真菌毒素污染,因此有必要檢查其中展青霉素量,保證用藥安全。近幾年來(lái)測(cè)定展青霉素的方法主要有高效液相色譜法以及高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法,前處理方法有液液萃取法、固相萃取法、多功能凈化柱凈化法等。液液萃取法的提取溶劑為乙酸乙酯,需消耗較多有機(jī)溶劑,操作步驟較為繁瑣。固相萃取法常用C18或HLB小柱進(jìn)行提取液的凈化,與液液萃取方法相比,樣品用量和溶劑用量均明顯減少,樣品的純化和富集過(guò)程可同時(shí)完成,縮短樣品處理時(shí)間。多功能凈化柱可選擇性吸附樣液中的雜質(zhì),而待測(cè)組分真菌毒素不被吸附而直接通過(guò),該方法操作步驟簡(jiǎn)單,凈化過(guò)程一步完成,已越來(lái)越多地應(yīng)用于展青霉素測(cè)定中。分子印跡固相萃取柱,是運(yùn)用分子印跡技術(shù)(molecularimprintingtechnique,MIT)原理,模擬抗原抗體反應(yīng)模式,將樣品中的目標(biāo)分子進(jìn)行特異性提純處理和富集。目前針對(duì)真菌毒素的分子印跡固相萃取柱的使用已經(jīng)有了一定的發(fā)展,并得到了廣泛的關(guān)注。實(shí)驗(yàn)中成功運(yùn)用了展青霉素分子印跡柱對(duì)中成藥提取液進(jìn)行凈化,其凈化過(guò)程迅速,選擇性高,可有效去除中藥中眾多干擾物質(zhì)。該方法的建立為更好地評(píng)價(jià)和控制山楂麥曲顆粒和大山楂顆粒質(zhì)量提供依據(jù),也為其他中成藥中的展青霉素測(cè)定提供參考方法。1試劑和儀器Agilent1200型液相色譜儀(Agilent公司);Milli-Q去離子水發(fā)生器(Milli-Q公司);OA-SYS氮吹儀(Ttettich公司)。展青霉素(patulin)對(duì)照品購(gòu)于Supelco公司,批號(hào)LB81487,純度96.592%;羥甲基糠醛(HMF)對(duì)照品購(gòu)于Dr.EhrenstorferGmbh公司,批號(hào)80606,純度98.7%;甲醇、乙腈為色譜純?cè)噭?水為超純水,其他試劑為分析純;展青霉素分子印跡柱購(gòu)于R.Biopharm公司,OasisHLB固相萃取小柱(500mg/6mL)購(gòu)于Waters公司,Mycosep228AflaPat多功能凈化柱購(gòu)于Romer公司。3批山楂麥曲顆粒(15g/袋)、2批大山楂顆粒(15g/袋)樣品購(gòu)自本地藥店。2方法和結(jié)果2.1動(dòng)相-乙腈溶液Kromasil100-5C18色譜柱(5μm,150mm×4.6mm);流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B),梯度洗脫(0~15min,4%A;15~20min,4%~40%A;20~25min,40%A;25~30min,40%~4%A),體積流量1.0mL/min;進(jìn)樣量50μL;柱溫35℃,檢測(cè)波長(zhǎng)276nm。2.3對(duì)照品溶液的配制取展青霉素適量用甲醇配制成1mg/mL貯備液,置于4℃保存,臨用時(shí)用0.1%乙酸溶液稀釋成適當(dāng)質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液。取羥甲基糠醛適量用甲醇配制成1mg/mL貯備液,置于4℃保存。2.4展激素的測(cè)定取展青霉素貯備液適量,配制成一系列質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液,分別進(jìn)樣進(jìn)行測(cè)定,以化合物峰面積(Y)和對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸,得到展青霉素線性范圍4.83~96.59ng/mL,線性方程Y=0.377X+0.0306,相關(guān)系數(shù)r為0.9999,線性關(guān)系良好。2.6檢測(cè)限制2.7樣品測(cè)定結(jié)果3討論3.1色譜分離系統(tǒng)的選擇流動(dòng)相的組成及比例對(duì)待測(cè)組分的峰形、分離度均有影響。實(shí)驗(yàn)中對(duì)乙腈-水、四氫呋喃-水、乙腈-磷酸溶液(pH2.5)等這3種流動(dòng)相體系進(jìn)行了考察,結(jié)果四氫呋喃系統(tǒng)、乙腈-磷酸溶液(pH2.5)系統(tǒng)的分離效果較差,而乙腈-水體系能很好地將展青霉素與雜質(zhì)峰分離。通過(guò)調(diào)整流動(dòng)相比例,當(dāng)乙腈與水的比例為4∶96時(shí),展青霉素出峰時(shí)間合適且分離度好。實(shí)驗(yàn)中還比較了Kromasil100-5C18、HypesilODS2C18和AgilentXDBC18色譜柱的分離效果,在乙腈-水體系下以Kromasil100-5C18柱的分離效果最好,且峰形尖銳,靈敏度高。因此選擇Kromasil100-5C18柱為分析柱,4%乙腈為流動(dòng)相作為色譜分離系統(tǒng)(圖1~3)。羥甲基糠醛是果實(shí)中己酮糖在酸性或高溫環(huán)境下脫水形成的產(chǎn)物,與展青霉素化學(xué)結(jié)構(gòu)相似,表現(xiàn)出相似的色譜行為,因此,羥甲基糠醛成為展青霉素測(cè)定時(shí)最常見(jiàn)、最易混淆的干擾物。在上述色譜系統(tǒng)下,將羥甲基糠醛和展青霉素的混合對(duì)照液進(jìn)樣,結(jié)果兩者分離良好(圖4)。3.2凈化方式的選擇中藥制劑中含有眾多成分,而展青霉素又是痕量存在的,需要采用適當(dāng)?shù)奶崛『蛢艋绞絹?lái)對(duì)樣品進(jìn)行處理,以便盡可能地減少干擾,提高分析靈敏度。由于顆粒劑中含有大量的糖分,若提取溶劑量少則提取溶液黏稠,不易通過(guò)凈化小柱,反之溶劑量過(guò)大則增加凈化時(shí)間。通過(guò)比較,確定加入5mL提取液時(shí),溶液黏度適中,過(guò)柱耗費(fèi)時(shí)間合適。超聲提取時(shí)間影響提取效率,實(shí)驗(yàn)中考察了提取時(shí)間分別為2、5、10min的提取回收率,在5min時(shí),提取回收率已經(jīng)達(dá)到最大,增加超聲時(shí)間,回收率并未顯著增大。因此將提取溶劑體積定為5mL,超聲提取時(shí)間為5min。實(shí)驗(yàn)中比較了常用于展青霉素凈化的幾種小柱的凈化效果:OasisHLB柱,mycosep228AflaPat多功能凈化小柱和展青霉素分子印跡柱。結(jié)果表明OasisHLB柱,mycosep228Aflapat多功能凈化小柱的凈化效果不能滿足要求,有雜質(zhì)峰干擾展青霉素的測(cè)定,經(jīng)過(guò)更換流動(dòng)相組成及比例均難以將雜質(zhì)與展青霉素分開(kāi),而采用展青霉素分子印跡柱凈化后的供試液無(wú)雜質(zhì)干擾,基線平穩(wěn),可準(zhǔn)確地分析展青霉素,因此選擇分子印跡柱作為凈化方式。實(shí)驗(yàn)中考察了在分子印跡柱上不同的洗脫溶劑(乙醚、乙腈、甲醇、乙酸乙酯)對(duì)加標(biāo)樣品的洗脫效果,結(jié)果表明乙酸乙酯的平均回收率最高,為77.1%,甲醇和乙醚的平均回收率分別為52.3%、40.5%,乙腈洗脫溶液中有干擾峰,未能計(jì)算回收率。比較之下乙酸乙酯洗脫色譜圖雜質(zhì)干擾峰少,回收率較高,洗脫效果好,因此,選擇乙酸乙酯作為洗脫液。本實(shí)驗(yàn)建立了山楂麥曲顆粒和大山楂顆粒中展青霉素的高效液相色譜檢測(cè)方法,采用展青霉素分子印跡固相親和柱對(duì)提取液進(jìn)行凈化可很好地去除干擾物,提高分析方法的專屬性。該方法操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高,回收率好,適用于中藥制劑的展青霉素的測(cè)定。2.2頻率對(duì)測(cè)定頻率的影響將供試品研細(xì),稱取約1g置于25mL具塞三角瓶中,加入5mL1%醋酸溶液,振搖溶解后超聲提取5min(超聲頻率40kHz)。依次用2mL乙腈、2mL水淋洗活化小柱,取上述提取液于已活化的分子印跡柱上,自然重力滴下,分別用1mL1%碳酸氫鈉溶液和2mL水淋洗,抽真空使柱子干燥,然后加入3mL乙酸乙酯溶液洗脫展青霉素,收集洗脫液于氮?dú)饬飨?0℃吹至近干,加入0.1%醋酸溶液溶解殘?jiān)⒍ㄈ葜?mL,用0.45μm微孔濾膜濾過(guò),供高效液相色譜儀測(cè)定。2.5檢測(cè)限和定量限稱取同一批陰性大山楂顆粒樣品9份,每份約1g,分別按50、20、5μg