一測(cè)多評(píng)法測(cè)定川芎、當(dāng)歸中4種多指標(biāo)成分

一測(cè)多評(píng)法測(cè)定川芎、當(dāng)歸中4種多指標(biāo)成分

川藥和當(dāng)歸通常用于中藥，歷史悠久。川芎為傘形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的干燥根莖38,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為上品,別名芎穹、西芎、撫芎等;當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels.的干燥根124。在化學(xué)成分上,兩者均含有機(jī)酸和內(nèi)酯類化合物,主要有阿魏酸、藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A、丁烯基苯酞等,這些成分均為川芎、當(dāng)歸的有效成分。從功效來說,川芎偏于行氣散血,當(dāng)歸偏于養(yǎng)血和血,兩者常配伍治療疾病,例如:腎氣丸、麻黃湯、升麻散、四物湯、桃仁湯、佛手散等,二藥伍用,互制其短而展其長,氣血兼顧,養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、行氣活血、散瘀止痛之力增強(qiáng),為臨床常用補(bǔ)血活血藥對(duì)。目前多見以阿魏酸、藁本內(nèi)酯等為單一質(zhì)控指標(biāo)同時(shí)控制川芎、當(dāng)歸質(zhì)量的報(bào)道。Yu等建立了HPLC法快速測(cè)定川芎、當(dāng)歸中阿魏酸松柏酯的含量;劉曉芳等建立了包含川芎、當(dāng)歸在內(nèi)的7種中藥材中阿魏酸含量測(cè)定的方法;胡杰等建立了同時(shí)測(cè)定川芎、當(dāng)歸中藁本內(nèi)酯含量的方法;劉云華等建立了同時(shí)測(cè)定川芎、當(dāng)歸藥材中總阿魏酸的含量方法。采用一測(cè)多評(píng)方法同時(shí)測(cè)定同時(shí)控制川芎或當(dāng)歸質(zhì)量的研究報(bào)道較為少見。劉云華等以丁基苯酞作為藁本內(nèi)酯的替代對(duì)照品,通過兩者之間校正因子的計(jì)算同時(shí)測(cè)定川芎藥材中的丁基苯酞和藁本內(nèi)酯的含量;張慧等測(cè)定了川芎中阿魏酸與洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯、3-正丁烯苯酞的相對(duì)校正因子,并進(jìn)行了含量測(cè)定。目前未見報(bào)道有同時(shí)建立川芎、當(dāng)歸多指標(biāo)化學(xué)成分一測(cè)多評(píng)的方法?；诖ㄜ骸?dāng)歸中部分主要有效化學(xué)成分相同,且洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯對(duì)照品制備困難,而不同類型化合物之間一測(cè)多評(píng)方法已多有報(bào)道,為簡(jiǎn)化檢測(cè)方法,在降低檢驗(yàn)成本的同時(shí),更加有效地控制川芎、當(dāng)歸的質(zhì)量,擬按照“一測(cè)多評(píng)法建立的技術(shù)指南”技術(shù)要求,以阿魏酸為內(nèi)標(biāo),建立同時(shí)測(cè)定川芎飲片、當(dāng)歸飲片中阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯4個(gè)化學(xué)成分含量的方法。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證,所建立的方法可用于川芎、當(dāng)歸的質(zhì)量控制。Agilent1200型快速液相色譜儀,具有在線脫氣機(jī)、輸液泵、柱溫箱、紫外檢測(cè)器VWD、自動(dòng)進(jìn)樣器;ThermoFisherUltiMateue4d23000高效液相色譜儀,具有在線脫氣機(jī)、輸液泵、柱溫箱、DAD檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器;SartoriusCP225D電子分析天平(德國賽多利斯集團(tuán));超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。1.2c73-13310、11937-2012-12復(fù)合材料對(duì)照品:阿魏酸(供含量測(cè)定用)、藁本內(nèi)酯(供薄層鑒別用,純度為95.0%)均購自中國食品藥品檢定研究院,批號(hào)分別為0773-9910、111737-201204;洋川芎內(nèi)酯Ⅰ(純度≥98%)、洋川芎內(nèi)酯A(純度≥98%)均購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司,批號(hào)分別為130410、130428。Milli-Q超純水,乙腈、甲醇為色譜純,Merck。飲片來源:川芎飲片及當(dāng)歸飲片均來自北京市多家飲片生產(chǎn)企業(yè),其中川芎飲片14批,酒川芎飲片10批,當(dāng)歸飲片16批,酒當(dāng)歸飲片10批。見表1。2.2溶液制備2.2.1混合對(duì)照溶液2.3方法研究2.3.1線性域研究2.3.2采用回歸因子計(jì)算2.4rcf因子精密吸取混合對(duì)照品溶液1、2、6、10、15、20μL進(jìn)樣分析,計(jì)算以阿魏酸為內(nèi)標(biāo)的洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯的相對(duì)校正因子(RCF)?？疾炝薃gilent1200、ThermoFisherUltiMateue4d130002種高效液相色譜系統(tǒng)和AgilentC18(4.6mm×150mm,3.5μm)、TechMateC18-STⅡ(4.6mm×250mm,5μm)、ThermoXLC18(4.6mm×150mm,5μm)3種不同品牌、規(guī)格的色譜柱,結(jié)果見表4。2.5外標(biāo)法與外標(biāo)法的比較取樣品按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定,利用“2.3.2”項(xiàng)下得到的平均相對(duì)校正因子計(jì)算川芎和當(dāng)歸中洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯含量,并分別與外標(biāo)法計(jì)算得到的含量進(jìn)行比較,結(jié)果見表5、6。3討論3.1分離條件的確定考察流動(dòng)相乙腈-不同濃度乙酸(0.10%、0.25%、0.50%和1.00%)、乙腈-不同濃度甲酸(0.10%、0.25%、0.50%和1.00%)、乙腈-水等9種溶劑系統(tǒng)對(duì)川芎、當(dāng)歸中化學(xué)成分分離情況,結(jié)果采用乙腈-水溶劑系統(tǒng)時(shí)阿魏酸出峰不好,加酸后明顯變好,但以乙腈-1.00%甲酸分離效果最好;考察0.6、0.8、1.0mL·min-13種流速對(duì)分離效果的影響,結(jié)果以0.8mL·min-1時(shí)分離最好;考察35、30、25℃3種溫度對(duì)分離效果的影響,結(jié)果以25℃時(shí)分離最好。3.2濃度溶劑、提取方式對(duì)洋基肥內(nèi)酯提取率的影響考察30%、50%、70%甲醇和純甲醇4種溶劑分別超聲、回流30min的提取率。結(jié)果表明,超聲、回流對(duì)藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A的提取率影響不大,不同濃度溶劑對(duì)藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯A提取率大小為:純甲醇略>70%甲醇>50%甲醇>30%甲醇;不同溶劑、不同提取方式對(duì)洋川芎內(nèi)酯Ⅰ提取率影響不大;超聲對(duì)阿魏酸的提取率較回流略低,相同提取方法、30%、50%、70%3種不同濃度甲醇對(duì)阿魏酸提取率差異不大,但純甲醇對(duì)阿魏酸提取率較30%、50%、70%甲醇要小很多。結(jié)合上述考察結(jié)果,考慮到中國藥典2010年版中川芎、當(dāng)歸的阿魏酸含量測(cè)定采用的是70%甲醇回流提取方法,最后選擇70%甲醇回流30min。3.3測(cè)定阿魏酸、洋基肥、洋基肥內(nèi)標(biāo)及其他本兩酯的含量研究中發(fā)現(xiàn)26批當(dāng)歸飲片中,多數(shù)樣品未檢出洋川芎內(nèi)酯A,僅個(gè)別樣品中檢出微量川芎內(nèi)酯A。因此,針對(duì)當(dāng)歸僅建立了以阿魏酸為內(nèi)標(biāo),測(cè)定阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ及藁本內(nèi)酯3種成分的一測(cè)多評(píng)方法。通過比較50份樣品,結(jié)果表明:川芎中阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ及藁本內(nèi)酯含量遠(yuǎn)高于當(dāng)歸中這3個(gè)成分含量,且多數(shù)當(dāng)歸飲片中未檢出洋川芎內(nèi)酯A,而在川芎中洋川芎內(nèi)酯A含量較高,與當(dāng)歸產(chǎn)生明顯區(qū)別,可考慮從這一成分上對(duì)川芎、當(dāng)歸進(jìn)行鑒別。1儀器和試劑盒1.1儀器2方法和結(jié)果2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法檢出限采用AgilentZORBAXSB(4.6mm×150mm,3.5μm)色譜柱,流動(dòng)相A為乙腈,流動(dòng)相B為1%甲酸,梯度洗脫(0~10min,10%A→28%A;10~17min,28%A→45%A;17~25min,45%A→65%A;25~30min,65%A→100%A;30~35min,100%A;35~37min,100%A→10%A;37~45min,10%A),流速0.8mL·min-1,檢測(cè)波長280nm,柱溫25℃,自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣,進(jìn)樣量10μL。HPLC圖見圖1。取阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯的對(duì)照品適量,精密稱定,置50mL量瓶中,加70%甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.3176、0.6034、0.6242、1.9908mg·mL-1的溶液。分別取上述對(duì)照品溶液0.30、0.17、0.73、0.23mL,置同一5mL量瓶中,加30%甲醇至刻度,搖勻,即得混合對(duì)照品溶液。2.2.2回歸方程的建立取飲片粉末(過4號(hào)篩)約0.2g,精密稱定,置100mL具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇25mL,稱定重量,置水浴上加熱回流30min,放冷,再稱定重量,用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,用0.45μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。精密吸取上述混合對(duì)照品溶液0.5、1、2、6、10、15、20μL,分別進(jìn)樣分析。以進(jìn)樣量對(duì)峰面積積分值進(jìn)行回歸處理,得阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯的回歸方程,結(jié)果表明各化學(xué)成分在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,見表2。分別精密吸取混合對(duì)照品溶液各0.5,1,2,6,10,15,20μL,進(jìn)樣,以阿魏酸為內(nèi)標(biāo),計(jì)算洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯的校正因子,見表32.3.3加樣回收試驗(yàn)分別取川芎飲片(批號(hào)20120508,No.3)和當(dāng)歸(批號(hào)20120410,No.10)飲片的粉末,按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)定,以相應(yīng)色譜峰的峰面積計(jì)算RSD,結(jié)果川芎飲片中阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯的RSD(n=6)分別為0.15%、0.12%、0.43%、0.17%;當(dāng)歸飲片中阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、藁本內(nèi)酯的RSD(n=6)分別為0.80%、0.36%、0.28%。表明該方法精密度良好。2.3.4加樣測(cè)定分別取同一批次川芎飲片(批號(hào)20120508,No.3)和當(dāng)歸(批號(hào)20120410,No.10)飲片的粉末,按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液各6份,進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果川芎飲片中阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯平均含量(n=6)分別為2.234、1.696、11.342、11.427mg·g-1,RSD分別為0.33%、0.10%、0.77%、0.37%;當(dāng)歸飲片中阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、藁本內(nèi)酯平均含量(n=6)分別為0.746、0.244、3.850mg·g-1,RSD分別為0.97%、0.87%、0.70%。表明該方法重復(fù)性良好。2.3.5年生中國飲料分別取同一批次川芎飲片(批號(hào)20120508,No.3)和當(dāng)歸(批號(hào)20120410,No.10)飲片的粉末,按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,分別在0、1、3、6、12、24h進(jìn)樣,川芎飲片中阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯峰面積的RSD(n=6)分別為0.69%、0.76%、0.11%、0.33%;當(dāng)歸飲片中阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、藁本內(nèi)酯峰面積的RSD(n=6)分別為1.5%、0.83%、0.43%,結(jié)果表明川芎、當(dāng)歸的供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。2.3.6對(duì)照品溶液的制備取已知含量的川芎飲片(批號(hào)20120508,No.3)和當(dāng)歸(批號(hào)20120410,No.10)飲片的粉末均為0.1g各6份,精密稱定。川芎飲片中分別精密加入阿魏酸對(duì)照品溶液(0.2223mg·mL-1)1mL、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ對(duì)照品溶液(0.1690mg·mL-1)1mL、洋川芎內(nèi)酯A對(duì)照品溶液(0.3845mg·mL-1)3mL、藁本內(nèi)酯對(duì)照品溶液(0.2431mg·mL-1)5mL;當(dāng)歸飲片中分別精密加入阿魏酸對(duì)照品溶液(0.0762mg·mL-1)1mL、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ對(duì)照品溶液(0.0241mg·mL-1)1mL和藁