生物制品的質(zhì)量檢驗-生物制品的效力檢驗

病毒滴度的測定原理(重點(diǎn))：適當(dāng)稀釋的病毒懸液與長成單層的宿主細(xì)胞混合，在細(xì)胞上覆以營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基等固體或半固體介質(zhì)，由于瓊脂的限制，病毒只能感染并破壞臨近的細(xì)胞，造成細(xì)胞溶解而形成空斑，每個空斑由一個病毒顆粒造成，計算空斑數(shù)量再乘以稀釋倍數(shù)即可得知原來的病毒感染單位的濃度?？瞻咝纬蓡挝环y定病毒滴度

空斑形成單位（PlaqueFormingUnits,PFUs)空斑顯現(xiàn)原理(掌握)：空斑形成后，經(jīng)中性紅活細(xì)胞染色，活細(xì)胞顯示紅色，而空斑區(qū)細(xì)胞不著色，形成不染色區(qū)域。空斑形成單位法測定病毒滴度Procedures適用條件(熟悉)：凡是能在細(xì)胞中產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)的病毒都可以采用空斑形成法測定病毒滴度?？瞻咝纬蓡挝环y定病毒滴度中性紅(掌握)(熟悉)(了解)(了解)空斑形成單位試驗技術(shù)舉例p51-52防止瓊脂凝固；Hanks液？雙抗？5%CO2空斑形成單位的計算(重點(diǎn))(掌握)(熟悉)CCID50ID50LD50(重點(diǎn))(熟悉)5%CO2培養(yǎng)箱(熟悉)CCID50TCID50(熟悉)病毒液CPE孔數(shù)無CPE累計出現(xiàn)CPE孔稀釋度孔數(shù)CPE孔數(shù)無CPE孔數(shù)所占的%10-180270100（27/27）

10-280190100（19/19）

10-37111191.6（11/12）

10-4354640（4/10）

10-5171130.7（1/14）

10-6080210（0/21）

Reed-Muench法計算CCID50CPE(陽性)孔累計數(shù)由下向上累積無CPE(陰性)孔累計數(shù)由上向下累積(難點(diǎn)、重點(diǎn))CCID50(難點(diǎn)、重點(diǎn))CalculationofTCID50

UseofReed&Muenchmethod(if50ulofvirusdilutionisaddedtoeach

well)Karber法計算CCID50

病毒液稀釋度出現(xiàn)CPE孔的比率10-18/8=110-28/8=110-37/8=0.87510-43/8=0.37510-51/8=0.12510-60/8=0(難點(diǎn)、重點(diǎn))lgCCID50=L+d(s-0.5)L:病毒的最低稀釋倍數(shù)的對數(shù)L=lg10-1=-1d：稀釋系數(shù)，即組距d=lg10-1=-1S：CPE(陽性)孔比率總和lgCCID50=(-1)+(-1)×(3.375-0.5)=-3.875CCID50=10-3.875/0.1mlID50和LD50的計算與CCID50完全相同(掌握)lgCCID50=L+d(s-0.5)ID50計算，S：感染比率總和；LD50計算，S：死亡比率總和；(掌握)血凝試驗的基本原理(掌握)紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象(血凝現(xiàn)象)紅細(xì)胞凝集抑制

(紅細(xì)胞與抗體結(jié)合，失去血凝)血凝滴度/血凝單位血凝試驗測定病毒滴度干擾滴定測定病毒滴度小結(jié)主要介紹空斑形成單位法、50%終點(diǎn)法、血凝試驗和干擾滴定法測定病毒滴度的原理及其方法；重點(diǎn)要掌握空斑形成單位法、50%終點(diǎn)法測定病毒滴度的原理及其滴度的計算；熟悉：空斑形成單位法、50%終點(diǎn)法、血凝試驗和干擾滴定法測定病毒滴度的具體方法；生物檢定法(Bioassay;Biologicalstandardization)

主要內(nèi)容第一節(jié)概述第二節(jié)生物檢定質(zhì)反應(yīng)的直接測定法第四節(jié)生物檢定法的應(yīng)用第三節(jié)生物檢定量反應(yīng)的平行線測定法第一節(jié)概述五.生物檢定的常用方法二.生物檢定的應(yīng)用范圍三.標(biāo)準(zhǔn)品四.生物檢定中的基本概念一.生物檢定法簡介六.生物檢定的步驟七.生物統(tǒng)計知識

一

生物檢定法簡介1.什么是生物檢定法？

待檢藥物被測物的相對效力（效價或毒性）有效性安全性生物體標(biāo)準(zhǔn)品活性反應(yīng)動物組織細(xì)胞微生物相對快速、重復(fù)性好、不能反映藥品的生物特異性和有效性反映藥品的生物特異性和有效性

繁瑣、誤差大2.生物檢定采用的實(shí)驗方法

定量、半定量、定性藥品的生物效價、安全檢查、鑒別

體外測定

(invitro)離體器官、組織,微生物,酶和細(xì)胞

體內(nèi)測定

(invivo)

整體動物類別3.生物檢定法特點(diǎn)

以藥理學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)(定量藥理學(xué)—劑量和反應(yīng)的函數(shù)關(guān)系)以標(biāo)準(zhǔn)品對比校驗為手段（在產(chǎn)生特定反應(yīng)情況下，以供試品與標(biāo)準(zhǔn)品劑量比值推算供試品效價）以生物統(tǒng)計學(xué)方法為結(jié)果判斷的依據(jù)真正的活性測定，與理化分析、蛋白結(jié)合試驗不同；但生物差異性大（實(shí)驗誤差大）、專業(yè)性強(qiáng)、實(shí)驗周期長，人力、物力消耗大，計算較繁?？刂粕锊町愋缘姆椒ㄅc措施:

生物來源、飼養(yǎng)或培養(yǎng)條件必須均一。采用特定的實(shí)驗設(shè)計,對影響實(shí)驗誤差的條件和因子進(jìn)行限制,減少實(shí)驗誤差。用生物統(tǒng)計方法提高實(shí)驗的可靠性。4.生物檢定的必要性理化方法不能反應(yīng)其活性。

為理化分析的補(bǔ)充多組分生物藥物無適當(dāng)理化方法進(jìn)行檢定；多組分、組分不明確、組成不定、結(jié)構(gòu)不清楚的藥物

抗生素、細(xì)胞因子類、血液制品、疫苗、酶(含異構(gòu)體)、多肽激素(含異構(gòu)體)。肝素天青A顯色比色法測定

×（但變性的肝素同時顯色，不能反應(yīng)肝素活性）所以:肝素抗凝血活性√應(yīng)用范圍342藥物效價測定1微量生理活性物質(zhì)測定某些有害雜質(zhì)限度檢查中藥質(zhì)量控制二生物檢定法的應(yīng)用范圍多組分生化藥物制劑、激素類藥物、生物制品:由結(jié)構(gòu)類似、而生物活性不同、比例不定的多種成份組成，或其組分不明確、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，難用理化方法反映其生物活性；雖可用理化方法測定含量，但含量不能完全反映效價（生物檢定是反映產(chǎn)品質(zhì)量的重要指標(biāo)，具有專屬性。當(dāng)前英國、美國及中國藥典都有收載）藥物效價測定生化藥物肝素、胰島素、縮宮素、絨促性素、硫酸魚精蛋白、精蛋白鋅胰島素、卵泡刺激素、黃體生成素、降鈣素、生長激素、升壓素等21個品種（約占我國生化藥的10%）抗生素生物制品

菌苗、疫苗、抗毒素、類毒素等藥典生物藥物效價測定品種:應(yīng)用范圍342藥物效價測定1微量生理活性物質(zhì)測定某些有害雜質(zhì)限度檢查中藥質(zhì)量控制二生物檢定法的應(yīng)用范圍

無菌、微生物限度、熱原、細(xì)菌內(nèi)毒素、異常毒性、降壓物質(zhì)、過敏等

藥典幾百種有害雜質(zhì)限度檢查應(yīng)用范圍342藥物效價測定1微量生理活性物質(zhì)測定某些有害雜質(zhì)限度檢查中藥質(zhì)量控制二生物檢定法的應(yīng)用范圍

一些神經(jīng)介質(zhì)，激素等微量生理活性物質(zhì)，由于其很強(qiáng)的生理活性，在體內(nèi)的濃度很低，加上體液中各種物質(zhì)的干擾，很難用理化方法測定。而不少活性物質(zhì)的生物測定法由于靈敏度高、專一性強(qiáng)，對供試品稍作處理即可直接測定。如乙酰膽堿，5-羥色胺等活性物質(zhì)的測定。微量生理活性物質(zhì)測定應(yīng)用范圍342藥物效價測定1微量生理活性物質(zhì)測定某些有害雜質(zhì)限度檢查中藥質(zhì)量控制二生物檢定法的應(yīng)用范圍中藥成份復(fù)雜，大部分中藥的有效成份尚未搞清，難以用理化方法加以控制，但可用一些以其療效為基礎(chǔ)的生物測定方法來控制其質(zhì)量。中藥質(zhì)量控制三標(biāo)準(zhǔn)品與供試品及其表示標(biāo)準(zhǔn)品（S）：系指用于生物檢定中效價測定的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以效價單位(U)表示。PS表示S的效價國家標(biāo)準(zhǔn)品：系指用國際標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定的用于定量測定某一制品效價或毒性的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其生物活性以國際單位（IU）或以單位（U）表示。

供試品（T）

供試品(T)是供檢定其效價的樣品,它的活性成分應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)品基本相同。

AT是T的標(biāo)示量或估計效價PT是經(jīng)檢定的T的效價,稱“測得效價”

效價是表達(dá)藥物效力強(qiáng)弱或活性物質(zhì)含量的一種公認(rèn)的劑量單位。效價單位（U）是衡量生物藥物有效成分效力的具體尺度。效價:用每毫升或每毫克中含有某種生物藥物的效價單位數(shù)表示藥物效力或濃度單位U/mg，U/mL例如:

青霉素鈉的效價為1670U/mg

慶大霉素的效價為590U/mg洋地黃的效價為10U/mL

效價單位(效應(yīng)濃度單位)（一）生物反應(yīng)（生物檢定的基礎(chǔ)）（二）劑量與反應(yīng)的關(guān)系（三）等反應(yīng)對比檢定四.效價檢定中的基本概念（一）生物反應(yīng)（生物檢定的基礎(chǔ)）藥物生物學(xué)定量法胰島素小鼠血糖降低法小鼠驚厥法肝素家兔血凝時間法抗生物微生物生長抑制法生物制品動物保護(hù)力活菌數(shù)和活病毒滴度生長激素

去垂體大白鼠體重法（二）劑量與反應(yīng)的關(guān)系生物反應(yīng)類型質(zhì)反應(yīng)：給藥后,觀察某一反應(yīng)的某一程度出現(xiàn)與否。如是否死亡、是否驚厥，是質(zhì)的變化，稱質(zhì)反應(yīng)。量反應(yīng)：藥物對生物體所引起的反應(yīng)隨著藥物劑量的增加產(chǎn)生的量變可以測量者,稱量反應(yīng)。如血壓、血凝時間、血糖等。劑量與反應(yīng)的關(guān)系某降壓藥：劑量降壓作用

1μg15mmHg2μg25mmHg3μg30mmHg劑量與反應(yīng)間一般呈曲線關(guān)系

劑量與反應(yīng)關(guān)系的直線化劑量與反應(yīng)間一般呈曲線關(guān)系將劑量取對數(shù)(lgd)后可與反應(yīng)(y)成直線關(guān)系生物檢定中的劑量常用對數(shù)表示

將藥物的供試品（T）和已知效價的標(biāo)準(zhǔn)品（S）對生物體進(jìn)行同時對比，以對T的效價（或毒力）進(jìn)行檢定的方法。屬于對比檢定。

（三）等反應(yīng)對比檢定**

（相對效力的計算）

S—dS（標(biāo)準(zhǔn)品劑量）；PS（標(biāo)準(zhǔn)品效價）T—dT（供試品劑量）；PT（供試品效價）

常以產(chǎn)生等反應(yīng)時的效價比值R得出R=PT/PS

對于量反應(yīng)：S和T各自的對數(shù)劑量和反應(yīng)應(yīng)呈直線關(guān)系S和T的兩條直線應(yīng)平行等反應(yīng)對比檢定原理

lgdS=XSlgdT=XTM=lgdS-lgdT=XS-XTS與T等反應(yīng)時所對應(yīng)劑量分別為：等反應(yīng)時:S和T中所含效價應(yīng)相等，即：

dT·PT=dS·PS（S和T中所含效價單位數(shù)）令：R=PT/PS=dS/dT

（1）

∴PT=R·PS

（2）

求出R就可以求出PT（R為等反應(yīng)效價的比值）（1）式兩邊取對數(shù)，lgR=lgPT/PS=lg(dS/dT)=lgdS-lgdT令lgR=M,lgd=X,則對數(shù)效價比值：

lgR=M=lgdS-lgdT=XS-XT

R=lg-1M=lg-1

(XS-XT)

PT==R·PS=lg-1M·PS實(shí)際工作中S的劑量常按已知效價計算，而T的劑量按標(biāo)示效價或估計效價（AT）來安排:

PT=R·AT

R=PT/PS=dS/dT

（1）五生物檢定的常用方法

(一)質(zhì)反應(yīng)的直接測定

(二)量反應(yīng)平行線測定法六生物檢定的步驟實(shí)驗設(shè)計的選擇反應(yīng)指標(biāo)的測定實(shí)驗可靠性檢驗(方差分析)相對效力的計算及可信限的估計學(xué)習(xí)要求特定的實(shí)驗設(shè)計-常用對稱定型實(shí)驗設(shè)計→看懂生物統(tǒng)計方法-常用定型公式或簡算法計算→弄懂基本道理;會套用七.生物統(tǒng)計知識

（實(shí)驗設(shè)計及方差分析）（四）實(shí)驗可靠性檢驗（方差分析)（一）實(shí)驗設(shè)計的目的（二）試驗設(shè)計重要三原則（三）生物檢定常用實(shí)驗設(shè)計一.實(shí)驗設(shè)計的目的最少的代價獲得最多的信息可有效排除混雜變異對結(jié)果的影響便于采用簡化計算

(采用定型對稱設(shè)計有利于有效性檢驗的簡化)采用特殊實(shí)驗設(shè)計

(提高精度和靈敏度)標(biāo)準(zhǔn)曲線法與量反應(yīng)平行線4.4法測定

LMWH產(chǎn)品抗FXa效價比較標(biāo)準(zhǔn)曲線法結(jié)果誤差大,重現(xiàn)性差,波動大,缺乏可比性；當(dāng)采用量反應(yīng)平行線原理的4·4實(shí)驗設(shè)計,結(jié)合生物統(tǒng)計,其結(jié)果較平穩(wěn),誤差小,重現(xiàn)性好。二.試驗設(shè)計重要三原則重復(fù)隨機(jī)對照

如：試驗?zāi)撤N降壓藥物的降壓作用：將20只雄性大鼠隨機(jī)分成兩組，每組10只，一組作為空白對照，一組給予待測藥物。

完全隨機(jī)化設(shè)計隨機(jī)區(qū)組設(shè)計交叉實(shí)驗設(shè)計三.生物檢定常用實(shí)驗設(shè)計

1完全隨機(jī)化設(shè)計動物號12345678910隨機(jī)號1203874596組別甲乙乙甲乙甲乙甲甲乙

將10個觀察對象隨機(jī)分為兩組：例：洋地黃效價測定——鴿最小致死量(MLD)法單號為甲組，雙號為乙組2隨機(jī)區(qū)組設(shè)計將分成8各區(qū)組（如來自8個窩的動物）的32個受試者隨機(jī)分配到A,B,C,D四個處理組各區(qū)組中的受試者被隨機(jī)分配接受的不同處理區(qū)組處理ABCD一1432二5687三1091211四16141315五19181720六23222124七28272625八30312932例：催產(chǎn)素生物檢定法——大鼠子宮法動物編號1234第一次STST第二次TSTS3.交叉實(shí)驗設(shè)計S為標(biāo)準(zhǔn)品組，T為供試品組平衡實(shí)驗次序的影響。把不同因素不同水平均攤于受試對象，去除試驗時間次序和試驗次序的影響例:小鼠血糖法測定胰島素效價處理在同一受試對象上重復(fù)觀察，由于處理是在同體上比較，從而避免了個體差異。四方差分析(F檢驗)

1.方差分析的概念

用于推斷多個總體均數(shù)有無差異(差異顯著性)的檢驗方法如：觀察四種降壓藥對大鼠的降壓效果或觀察四個劑量的降壓藥對大鼠的降壓效果2.方差S2：是測量值在其總體均值周圍分布狀況的一種量度，方差表征隨機(jī)變量分布的離散程度。方差S2==f

=n-1自由度離均差∑(yi-)2fSSf方差S2==f

=n-1fSSf方差S2==差方和SSf

=n-1fSSf方差S2==f

=n-1fSSf方差S2==f

=n-1fSSf方差S2==f

=n-1f

SSf組間變異總變異組內(nèi)變異組間變異（處理效應(yīng)）用組間方差表示；組內(nèi)變異（隨機(jī)誤差）用組內(nèi)方差表示。

3.方差分析原理

S2總=S2處理+S2誤差

s2總=s2處理

+s2誤差

4方差和F值計算方法

SS總=SS處理+SS誤差

f總=f處理+f誤差

SS誤差=SS總－SS處理

f誤差=f總－

f處理

s2總=SS總/f總；s2處理=SS處理/

f處理

s2誤差=SS誤差/f誤差誤差項S2F值=處理效應(yīng)方差S2

SS處理f

SS誤差f=方差分析（F檢驗）:

以處理組方差(S2)與誤差項方差（S2（誤差））的比值（稱F值）來確定處理效應(yīng)差異的顯著性程度。

查F值表，當(dāng)F計算值大于P＝0.05或P＝0.01的查表值時，則P＜0.05或P＜0.01，即為在此概率水平下該項變異有顯著意義。5.方差分析(F檢驗)的步驟建立檢驗假設(shè)：無效假設(shè)把處理間的方差μ12與誤差的方差假設(shè)相等即：H0：μ12=μ22

；備擇假設(shè)HA：μ12≠μ22計算各處理組的方差及組內(nèi)的方差，求出相應(yīng)的F值。計算所得的F值與F表中按一定自由度查得的F0.05或F0.01進(jìn)行比較若處理組F＞F0.05（F0.01）則拒絕H0，接受HA，認(rèn)為該處理所引起的差異有顯著（極顯著）意義。若處理組F＜F0.05則接受H0，認(rèn)為該處理所引起的差異無顯著意義。第二節(jié)質(zhì)反應(yīng)的直接測定一.測定程序

將實(shí)驗對象隨機(jī)分成兩組，S組與T組，分別測定兩組的MED（最小效量）——y值計算出M、R和PT估計實(shí)驗誤差（用可信限（FL）表示）以產(chǎn)生質(zhì)反應(yīng)的最低效量(MED)為反應(yīng)指標(biāo)（y）

按公式計算出M，再求算R和PT：

R=lg-1MPT=R·AT二.M和PT的計算R=

PT/PS=dS/dT誤差項方差S2的計算三.實(shí)驗誤差的估計（用可信限（FL）表示）步驟：標(biāo)準(zhǔn)誤SM的計算可信限（FL）的計算1.誤差項方差S2的計算S2=(∑XS2－)+(∑XT2－）(∑XS)2nS(∑XT)2nTnS+nT-2nS、nT為標(biāo)準(zhǔn)品和供試品的反應(yīng)個數(shù)2.標(biāo)準(zhǔn)誤SM的計算

是指平均數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差,即各均數(shù)之間差異的大小,用SM表示,SM越小差異也越小。S

2為誤差項方差nS、nT分別為標(biāo)準(zhǔn)品和供試品的反應(yīng)個數(shù)用SM對總體均數(shù)進(jìn)行評估，計算可信限。

標(biāo)志檢定(R和PT)結(jié)果的精確度

R的FL=lg-1(M±t·SM)PT的FL=AT·lg-1(M±t·SM)

t(f,0.05)：根據(jù)f和概率水平查表獲得R或PT高限-R或PT低限2R或2PT3可信限（FL）的計算R或PT的FL%=×100%除藥典另有規(guī)定外，可信限率不得大于5%。4.示例:質(zhì)反應(yīng)直接測定法

洋地黃效價的測定——鴿最小致死量（MLD）法本法系比較洋地黃標(biāo)準(zhǔn)品(S)與供試品(T)對鴿的最小致死量(MLD，U/kg)，以測定供試品的效價。

實(shí)驗方法：

標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液(S)0.9％氯化鈉1→30稀釋(使MLD在25～34ml)供試品溶液和稀釋液的配制供試品(T)按AT配制和稀釋(AT=10U/g)使鴿與S接近檢定法按直接測定法計算效價(PT)及實(shí)驗誤差FL(％)本法的可信限率FL(％)不得大于15％。

鴿(250～400g)標(biāo)準(zhǔn)品組(6只)供試品組

(6只)注射S至死亡MLDS(U／Kg)MLDT

(U／Kg)注射T至死亡STMLDS（dS）XSXS2MLDT(dT）XTXT2U/kg體重Lg(dS×10)U/kg體重Lg(dS×10)1.151.0611.1261.111.0451.0921.011.0041.0081.231.0901.1881.101.0411.0841.061.0251.0511.141.0571.1171.311.1171.2481.061.0251.0510.940.9730.9470.950.9780.9561.361.1341.286∑XS6.166∑XT6.384XS1.028XT1.064

測定結(jié)果(∑X)2

38.019

40.755

∑X26.3426.811

效價的計算

M==1.028-1.064=-0.036

R=lg-1M=antilgM=antilg(-0.036)=0.9204

PT=R·AT=0.9204×10U/g=0.9204U/g已知：XS=1.028；XT=1.064；AT=10U/g誤差項S2及可信限計算S2=(∑XS2－)+(∑XT2－）(∑XS)2nS(∑XT)2nTnS+nT-2=0.002373已知：

∑XS2=6.342

∑XT2=6.811

(∑XS)2=38.019

(∑XT)2=40.755nS=nT=6＝0.02812

R的FL=lg-1(M±t·SM)

查t值表t(10)0.05=2.23（P=0.95）lg-1(M+t·SM)是R的高限;lg-1(M-t·SM)是R的低限

PT的FL=AT·

lg-1

(M±t·SM)

AT·lg-1(M＋t·SM)是PT的高限；AT·lg-1(M－t·SM)是PT的低限

PT的FL=7.97～10.6(U/g)

PT的FL%=10.6-7.972×9.20×100%=14.3%R(或PT)的FL%=R高限(或PT高限)-R低限(或PT低限)2R（2PT）×100%結(jié)果PT的FL%＜15％，實(shí)驗結(jié)果可靠。直接測定法的優(yōu)點(diǎn)：

可使用較少量的動物，直接測得S和T的等反應(yīng)劑量直接測定法常用的實(shí)驗設(shè)計：

隨機(jī)設(shè)計配對交叉設(shè)計小結(jié)對于量反應(yīng)：S和T各自的對數(shù)劑量和反應(yīng)應(yīng)呈直線關(guān)系S和T的兩條直線應(yīng)平行一.量反應(yīng)的平行線關(guān)系第三節(jié)量反應(yīng)平行線測定法

∵R=dS/dT；lgR=lgdS-lgdT=XS-XT=M∴R=lg-1M=lg-1（XS-XT）

當(dāng)供試品按標(biāo)示量或估計效價進(jìn)行試驗時:

PT=AT·R

或PT=AT·lg-1M量反應(yīng)的測定方法:常用(k.k)法，如(2.2法)和（3.3法）?；蚍Q4點(diǎn)法（S和T各用2個劑量組）和6點(diǎn)法（S和T各用3個劑量組）。二.測定原理

等反應(yīng)時(yS=yT):dT·PT=dS·PS則：

R=PT/PS=dS/dT令：M=

XS-XT三.量反應(yīng)平行線法常用的實(shí)驗設(shè)計隨機(jī)設(shè)計隨機(jī)區(qū)組設(shè)計交叉設(shè)計

四.測定步驟按定型實(shí)驗設(shè)計進(jìn)行指標(biāo)測定；將測得反應(yīng)值(y)按劑量分組列成方陣表;方差計算和可靠性檢驗（采用定型公式的簡算法）；進(jìn)行效價及可信限計算（采用定型公式的簡算法）。(一)藥典對各種(k.k)法的要求

S和T相鄰高低劑量組的比值（r）要相等，一般r用（1∶0.8)--（１∶０.5），lgr=I。各劑量組的反應(yīng)個數(shù)(m)應(yīng)相等。

k為S和T的劑量組數(shù)之和（k+k）。

（二）將反應(yīng)值(y)按S和T的劑量分組列成方陣表k為S和T的劑量組數(shù)和，m為各劑量組內(nèi)y的個數(shù)

1.可靠性檢驗的項目：劑間差別(即期望顯著P＜0.05)(檢測不同劑量所致反應(yīng)是否有明顯的差別)。試品間的差別（期望不顯著P＞0.05）（標(biāo)準(zhǔn)品與供試品間的差異）回歸差別(期望非常顯著P＜0.01)（檢測劑量與反應(yīng)是否成直線）偏離平行差別(期望不顯著P＞0.05)(檢測標(biāo)準(zhǔn)品與供試品間直線是否平行)（三）量反應(yīng)平行線測定可靠性檢測

以劑間（列）、試品間、回歸、偏離平行的方差(S2)與誤差項方差（S2（誤差））的比值（稱F值）來確定各自差異的顯著性程度和實(shí)驗結(jié)果的可靠性。

2.可靠性檢驗的原理誤差項S2F值=該項方差S2查F值表，當(dāng)F計算值大于P＝0.05或P＝0.01的查表值時，則P＜0.05或P＜0.01，即為在此概率水平下該項變異有顯著意義。（1）各檢驗項方差（S2）的計算S2（總）=S2（劑間）+S2（區(qū)組間）+S2（誤差）

劑間方差（S2劑間）可分解為各具一個自由度的方差：包括試品間、回歸、偏離平行……的方差（2）劑間變異的方差分析(S2劑間=S2試品間+S2回歸+S2偏離平行+S2二次曲線+……)各項劑間變異的方差根據(jù)正交多項系數(shù)進(jìn)行求算自由度(f)S2=各項差方和(SS2)Ci正交多項系數(shù)各項劑間變異的方差計算：

f

=1

方法差異來源∑y(k)正交多項系數(shù)(Ci)分母m∑Ci2分子∑[Ci·∑y(k)]2S1S2S3T1T2T32.2四點(diǎn)法試品間-1-1114m回歸-11-114m偏離平行1-1-114m3.3六點(diǎn)法試品間-1-1-11116m回歸-101-1014m偏離平行10-1-1014m二次曲線1-211-2112m反向二次-12-11-2112m四點(diǎn)法：試品間∑(Ci∑y(k))=T1+T2-S1-S2回歸∑(Ci∑y(k))=T2-T1+S2-S1偏離平行∑(Ci∑y(k))=T2-T1-S2+S1各項劑間變異的方差計算公式（3）誤差項方差（S2誤差）的計算：差方和（誤差）=差方和（總）-差方和（劑間）-差方和（區(qū)組間）

f（誤差）=f（總）-f（劑間）-f（區(qū)組間）f（誤差）S2（誤差）

=差方和（誤差）不易直接得出，一般由以下公式推出：（4）效價測定的可靠性測驗結(jié)果劑間變異分解

各種(k·k)法都按表計算V、W、D、A、B、g等數(shù)值，代入公式(1)～(4),計算R、SM、PT以及R、PT的FL和FL％等。五.效價(PT)及可信限(FL)計算（簡算法）（V、W、D、A、B、g等值均用S，T，dS，dT值求算）計算軟件：

中國藥典生物檢定統(tǒng)計程序BS2000ForWin-dows9X六.量反應(yīng)平行線法測定實(shí)例

1.縮宮素效價測定S為縮宮素標(biāo)準(zhǔn)品:

dS1:0.0068udS1:0.009u

T為縮宮素注射液

標(biāo)示量AT:10u/mldT1:0.008udT2:0.0106ur=1:0.75I=lgr=lg(1/0.75)=0.125

反應(yīng)(y):子宮收縮高度(mm)(隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(2.2)法)①實(shí)驗安排②給藥順序

將標(biāo)準(zhǔn)品和供試品高低2個劑量組S1，S2，T1，T2分別用ABCD表示，作出5組收縮數(shù)據(jù)（5個區(qū)組）。

給藥順序：ABCDBCDACDABDABCCBDA

劑量dS10.0068dS20.0090dT10.0080dT20.0106∑ymy39.568.041.071.0219.537.062.536.053.0188.535.063.037.062.0197.031.558.034.560.0184.030.050.035.060.0175.0173.0301.5183.5306.0964.0∑y(k)S1S2T1T2隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(2.2)法，K=4，每組4個劑量為一個區(qū)組，m=5③將反應(yīng)值(y)按S和T的劑量分組列成方陣表④可靠性檢驗總差方和,劑間,區(qū)組間,誤差項差方和及自由度計算劑間變異分析可靠性檢驗=39.52+37.02+……+60.02+60.02-(964.0)2/(5*4)=3600.20

f=mk-1=5×4-1=19

=(173.022+301.522+183.522+306.022)/5-(964.0)2/(5×4)=3163.10

f=k-1=4-1=3總差方和,劑間,區(qū)組間,誤差項差方和及自由度總差方和劑間差方和SS誤差=SS總-SS組間-SS區(qū)組=(219.52+188.52+…..+184.02+175.02)/4－(964.0)2/(5×4)=285.82f=m-1=5-1=4SS

(誤差)

=3600.20－

3163.10－

285.82=151.28區(qū)組間差方和誤差項差方和f=f總－f組間－f區(qū)組=19－3－4=12劑間各項變異包括：(2.2)試品間、回歸、偏離平行劑間各項變異方差計算各項變異差方和=[∑(Ci∑y(k)]2/m∑Ci2Ci為正交多項系數(shù)，各變異項的正交多項系數(shù)計算方法見下表表（2,2）法劑間各項變異差方和計算方法試品間∑(Ci∑y(k))=T1+T2-S1-S2回歸∑(Ci∑y(k))=T2-T1+S2-S1偏離平行∑(Ci∑y(k))=T2-T1-S2+S1變異來源

∑y(k)分母m∑Ci2分子∑[Ci∑y(k)]差方和[∑(Ciy(k)]2/(m∑Ci2)S1173.0S2301.5T1183.5T2306.0

正交多項系數(shù)(Ci)試品間-1-1115×415.011.25回歸-11-115×4251.03150.05偏離平行1-1-115×46.001.80縮宮素效價測定(2.2)法可靠性測驗結(jié)果變異來源f差方和方差FP試品間111.2511.25＜1＞0.05回歸13150.053150.05229.09＜0.01偏離平行11.801.80＜1＞0.05

劑間33163.101054.3776.67＜0.01區(qū)組間4285.8271.465.20＜0.05誤差12151.2712.61(S2)＞0.01總193600.20結(jié)論:回歸非常顯著(P＜0.01),偏離平行不顯著(P＞0.05),實(shí)驗結(jié)果成立。區(qū)組間差異顯著(P＜0.05),分離區(qū)組間變異,可以減少實(shí)驗誤差。

效價(PT)及可信限(FL)計算已知:

r=1:0.75,I=0.125,S2=12.61,f=12,t=2.20AT=10U/ml，m=5計算:

V,W,g,R,PT

V=1/2(T1+T2-S1-S2)=7.5W=1/2(T2-T1+S2-S1)=125.5

S2×t2×mW2=0.021g=WIVR=Dlg-1=0.864PT=AT·R=10×0.864=8.64(U/ml)D=dS2/dT2=0.009/0.0106A=1B=1SM=×1W2×(1-g)mS2(1-g)AW2+BV2=0.0083632R的FL=lg-1±t·SM)=0.826~0.899lgR1-gPT的FL=AT·lg-1

±t·SM)=8.26~8.99(u/ml)PT的FL%=×100%=4.2%PT高限-PT低限2×PTlgR1-g2.胰島素生物檢定法小鼠血糖測定法雙交叉設(shè)計量反應(yīng)平行線法P113①方法可靠性檢驗②PT和FL計算（自學(xué)）3.抗生素微生物檢定法量反應(yīng)平行線(2,2)或(3,3)法常用瓊脂擴(kuò)散法-管碟法4.葡萄糖酸銻鈉毒力檢查法產(chǎn)品毒性不穩(wěn)定，受工藝影響大，須逐批進(jìn)行毒性檢驗。本法系比較葡萄糖酸銻鈉標(biāo)準(zhǔn)品（S）與供試品（T）引致小鼠死亡的鼠數(shù)，以判定供試品毒力是否符合規(guī)定。

以小鼠死亡數(shù)為指標(biāo)檢查法小鼠40只標(biāo)準(zhǔn)品組20只供試品組20只

尾靜脈注0.02ml/1g體重記錄小鼠死亡數(shù)結(jié)果判斷T(死亡數(shù))＜S(死亡數(shù))合格T(死亡數(shù))＞S(死亡數(shù))不合格5.肝素生物檢定法（隨機(jī)或隨機(jī)區(qū)組設(shè)計）

本法系比較肝素標(biāo)準(zhǔn)品(S)與供試品(T)延長新鮮兔血或兔、豬血漿凝結(jié)時間的作用,以測定供試品的效價。（2.2）四點(diǎn)法或（3.3）六點(diǎn)法家兔全血或血漿法第四節(jié)生物檢定法的應(yīng)用

一縮宮素的生物檢定實(shí)驗（一）概述來源：縮宮素即催產(chǎn)素由哺乳動物腦垂體后葉分離精制或化學(xué)合成的?；瘜W(xué)本質(zhì)：由8種氨基酸組成的多肽化合物。物理性質(zhì)：能溶于水，在弱酸性溶液中穩(wěn)定，在堿性溶液中易失去活性。藥理作用:

為收縮平滑肌，對子宮平滑肌有選擇性興奮作用，在一定的生理狀態(tài)下，使子宮產(chǎn)生節(jié)律性收縮，并有生乳作用。

檢定方法：

各國檢定方法不同?！吨袊幍洹?2005)采用大鼠離體子宮法，該法系比較垂體后葉標(biāo)準(zhǔn)品(S)與供試品(T)引起離體大鼠子宮收縮的作用，以測定供試品的效價。（二）實(shí)驗設(shè)計

采用(2.2)法隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，r=1：0.7選擇標(biāo)準(zhǔn)品和供試品反應(yīng)適度的高低兩個劑量。標(biāo)準(zhǔn)品和供試品高低四個劑量為一組，以A、B、C、D表示做出4～6組收縮記錄，可按以下順序給藥：ABCD、BCDA、CDAB、DABC、ACBD、CBDA、BDAC、DACB、ADCB、DCBA……。（三）縮宮素檢定法的操作步驟（一）選擇大鼠（動情期）（二）處死大鼠、取子宮（三）清除結(jié)締組織、固定子宮?。ㄋ模┱{(diào)節(jié)記錄裝置與測試子宮肌靈敏度（五）給藥測定（四）計算檢定的實(shí)驗結(jié)果1.將反應(yīng)值(y)按生物檢定統(tǒng)計法格式整理2.量反應(yīng)平行線測定(2.2)法隨機(jī)區(qū)組設(shè)計的公式(實(shí)驗中隨給藥次數(shù)增加而呈明顯遞增或遞減時，用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計)處理結(jié)果。進(jìn)行可靠性測驗，實(shí)驗結(jié)果成立者，再進(jìn)行以下計算。分別計算M、R、PT、SM、FL、FL％。本法的可信限率(FL％)不得大于10％。動物血壓器官測量儀成年雌性大鼠取選定的大鼠迅