TRIM31在抗病毒天然免疫中的功能及其機(jī)制研究

TRIM31在抗病毒天然免疫中的功效及其機(jī)制研究固有免疫是機(jī)體抵抗外界病毒、細(xì)菌等微生物感染的第一道防線(xiàn),病毒的核酸成分能夠引發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答反映。固有免疫的激活需要模式識(shí)別受體(patternrecognitionreceptors.PRRs)識(shí)別病原有關(guān)分子模式(Pathogenassociatedmolecularpatterns,PAMPs)。細(xì)胞內(nèi)存在的多個(gè)模式識(shí)別受體能夠識(shí)別病毒的核酸成分,如Toll樣受體(Toll-likereceptors.TLRs)中的TLR3、TLR7、TLR8和TLR9,能夠識(shí)別暴露于細(xì)胞內(nèi)體中中的病毒RNA和DNA。細(xì)胞漿中游離的RNA成分可被維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ受體(RIG-I-likereceptors,RLRs)中的RIG-I或MDA5所識(shí)別。游離于細(xì)胞漿中的病毒DNA成分則能夠被cGAS、IFI16、DDX41等DNA受體識(shí)別。天然免疫細(xì)胞的PRRs識(shí)別病毒的核酸成分后,引發(fā)一系列信號(hào)通路的活化,誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生,最后去除感染機(jī)體的病原微生物。線(xiàn)粒體抗病毒蛋白MAVS(也被稱(chēng)作IPS1,VISA或Cardif)是RLRs信號(hào)通路中重要的接頭分子。研究表明,RNA病毒感染機(jī)體后可引發(fā)MAVS構(gòu)象發(fā)生變化,形成朊蛋白樣(prion-like)聚集體。MAVS朊蛋白白樣聚集體的形成對(duì)RLRs信號(hào)通路的活化起著核心作用,然而MAVS形成聚集體的分了機(jī)制并不清晰。MAVS在線(xiàn)粒體上的定位對(duì)其功效發(fā)揮起著決定性的作用,因此我們假設(shè)定位于線(xiàn)粒體上的蛋白可能會(huì)對(duì)MAVS的功效有一定的調(diào)控作用。TRIM31屬于E3泛素連接酶家族中的一員,在癌癥等人類(lèi)疾病中發(fā)揮著重要作用,也有文章報(bào)道TRIM31能夠部分定位在線(xiàn)粒體上,因此本論文探索了TRIM31與否通過(guò)影響MAVS功效進(jìn)而調(diào)控天然免疫抗病毒反映。我們的研究發(fā)現(xiàn)TRIM31能夠正向調(diào)控MAVS所介導(dǎo)的Ⅰ型干擾素的生成,TRIM31特異性敲基因小鼠更加易于感染RNA病毒。具體機(jī)制依賴(lài)于TRIM31能夠?qū)AVS第10位、第311位及第461位的賴(lài)氨酸進(jìn)行K63位泛素化修飾,從而增進(jìn)MAVS朊蛋白樣聚集體的形成,最后增進(jìn)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。一.研究目的:探討TRIM31與否影響MAVS所介導(dǎo)的信號(hào)通路,并闡明其具體分子機(jī)制,最后通過(guò)敲基因小鼠動(dòng)物模型驗(yàn)證TRIM31影響抗病毒天然免疫的生理意義。二.研究辦法:1.TRIM31在細(xì)胞內(nèi)的定位將含GFP標(biāo)簽的TRIM31過(guò)體現(xiàn)載體轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中,培養(yǎng)24小時(shí)后,SeV感染6小時(shí)。免疫熒光技術(shù)檢測(cè)TRIM31在線(xiàn)粒體上的定位狀況。取健康C57BL/6小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞,SeV感染不同時(shí)間點(diǎn)后,提取線(xiàn)粒體蛋白,WesternBlotting辦法檢測(cè)TRIM31在細(xì)胞漿及線(xiàn)粒體上的蛋白含量。2.TRIM31調(diào)控IFN-β的產(chǎn)生和抗病毒反映2.1TRIM31過(guò)體現(xiàn)對(duì)IFN-β產(chǎn)生的影響在HEK293T細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染Flag標(biāo)簽的TRIM31過(guò)體現(xiàn)載體,培養(yǎng)24小時(shí)后,SeV感染或轉(zhuǎn)染poly(I:C)系列時(shí)間點(diǎn),實(shí)時(shí)熒光定量PCR辦法檢測(cè)IFN-β產(chǎn)生的變化。2.2TRIM31干擾后對(duì)IFN-β產(chǎn)生的影響提取小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞,轉(zhuǎn)染小干擾RNA減低TRIM31的體現(xiàn),SeV感染不同時(shí)間點(diǎn),實(shí)時(shí)熒光定量PCR和ELISA技術(shù)檢測(cè)IFN-β產(chǎn)生及分泌。2.3TRIM31對(duì)病毒復(fù)制的影響分別轉(zhuǎn)染TRIM31干擾RNA或者TRIM31過(guò)體現(xiàn)載體于HEK293T細(xì)胞中,用VSV感染不同時(shí)間點(diǎn),實(shí)時(shí)熒光定量PCR辦法檢測(cè)IFN-β產(chǎn)生和VSVmRNA水平的變化;運(yùn)用熒光顯微鏡直接觀察病毒的復(fù)制狀況;收集細(xì)胞上清,運(yùn)用病毒空斑實(shí)驗(yàn)檢測(cè)病毒滴度狀況。3.TRIM31敲除對(duì)機(jī)體抗病毒的生理意義3.1TRIM31敲除后對(duì)IFN-β產(chǎn)生的影響提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞,分別用5’ppp-RNA、LPS、Poly(I:C)等刺激,或者SeV、HSV-1感染,實(shí)時(shí)熒光定量PCR辦法檢測(cè)IFN-β及IFN有關(guān)基因的體現(xiàn)。3.2TRIM31敲除對(duì)機(jī)體中病毒復(fù)制的影響取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞,用VSV或HSV-1感染不同時(shí)間點(diǎn),實(shí)時(shí)熒光定量PCR辦法檢測(cè)IFN-β體現(xiàn)和病毒mRNA水平的變化;收集細(xì)胞上清,病毒空斑實(shí)驗(yàn)辦法檢測(cè)病毒滴度;WesternBlotting辦法檢測(cè)VSV蛋白的體現(xiàn)變化。取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠,腹腔注射VSV或HSV-1,24小時(shí)后小鼠眼球取血的到血清,ELISA檢測(cè)血清中IFN-β分泌變化;取肝臟、脾臟、肺臟及腦組織,提取總RNA,實(shí)時(shí)熒光定量PCR辦法檢測(cè)組織中IFN-β和病毒mRNA水平的變化;提取蛋白白,WesternBlotting辦法檢測(cè)VSV蛋白水平的變化;組織研磨得到上清,病毒空斑實(shí)驗(yàn)辦法檢測(cè)病毒滴度變化;免疫組化及HE染色辦法觀察組織損傷狀況。4.TRIM31對(duì)RLR信號(hào)通路活化的影響將TRIM31過(guò)體現(xiàn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞系24小時(shí)后,SeV或HSV-1感染不同時(shí)間點(diǎn),WesternBlotting檢測(cè)TBK-1、IRF3磷酸化狀況及IRF3在胞質(zhì)、胞核中的含量變化狀況;非變性WesternBlotting檢測(cè)IRF3二聚化狀況;通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因手段檢測(cè)IRF3報(bào)告基因活性的變化狀況。取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞,SeV或HSV-1感染不同時(shí)間點(diǎn),WesternBlotting檢測(cè)TBK-1、IRF3磷酸化狀況及IRF3在胞質(zhì)、胞核中的變化狀況;非變性WesternBlotting檢測(cè)IRF3二聚化狀況。5.TRIM31靶分子的尋找將RLR信號(hào)通路中有關(guān)的接頭分子RIG-I、MDA5、MAVS、TBK1、IKKε、IRF3-5D等過(guò)體現(xiàn)載體與TRIM31體現(xiàn)載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞系,運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)檢測(cè)TRIM31對(duì)不同接頭蛋白所介導(dǎo)的IFN-β卩mRNA體現(xiàn)及報(bào)告基因活性的影響。將有關(guān)接頭分子過(guò)體現(xiàn)載體與TRIM31體現(xiàn)載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TRIM31與各接頭分子的結(jié)合狀況。6.TRIM31與MAVS結(jié)合實(shí)驗(yàn)提取C56BL/6小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞,SeV感染不同時(shí)間點(diǎn),用TRIM31特異性抗體進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),檢測(cè)內(nèi)源性TRIM31與MAVS的結(jié)合。運(yùn)用體外翻譯系統(tǒng)分別得到TRIM31與MAVS的蛋白,免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)體外體現(xiàn)的TRIM31與MAVS的結(jié)合狀況。分別構(gòu)建TRIM31的截?cái)嗤蛔凅w與MAVS的截?cái)嗤蛔凅w,共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞系,免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TRIM31與MAVS的截?cái)嗤蛔凅w的結(jié)合狀況,尋找TRIM31與MAVS發(fā)生結(jié)合的核心構(gòu)造域。7.TRIM31對(duì)MAVS的泛素化狀況將Flag標(biāo)簽的TRIM31過(guò)體現(xiàn)載體、Myc標(biāo)簽的目的分子過(guò)體現(xiàn)載體和HA標(biāo)簽的泛素過(guò)體現(xiàn)載體(WT、K48或K63)共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞系,24小時(shí)后提取蛋白,用Myc特異性抗體進(jìn)行免疫共沉淀,WesternBlotting檢測(cè)TRIM31對(duì)目的分子泛素化水平的影響及泛素化形式的影響。構(gòu)建一系列Myc標(biāo)簽的MAVS賴(lài)氨酸點(diǎn)突變過(guò)體現(xiàn)載體,分別與Flag標(biāo)簽的TRIM31過(guò)體現(xiàn)載體和HA標(biāo)簽的泛素過(guò)體現(xiàn)載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞系,24小時(shí)后提取蛋白,免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)TRIM31對(duì)不同賴(lài)氨酸點(diǎn)突變載體泛素化的影響,探討MAVS上被TRIM31催化形成泛素鏈的賴(lài)氨酸位點(diǎn)。提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞,SeV感染不同時(shí)間點(diǎn)后,提取細(xì)胞蛋白,運(yùn)用MAVS特異性抗體進(jìn)行免疫共沉淀,WesternBlotting辦法檢測(cè)TRIM31對(duì)MAVS內(nèi)源性泛素化水平的影響。將MAVS構(gòu)建到含有T7啟動(dòng)子的PCDNA3.1-Myc過(guò)體現(xiàn)載體,將TRIM31構(gòu)建到含有T7啟動(dòng)子的PCDNA3.1-Flag過(guò)體現(xiàn)載體上,使用Promega公司的體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)(TNTQuickCoupledTranscription/TranslationSystem)對(duì)體現(xiàn)載體進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄翻譯,將翻譯的蛋白,加入BostonBiochem公司生產(chǎn)的體外泛素修飾系統(tǒng)(包含El,UbcH5a,K48.K63,K48R或者K63R等蛋白),室溫反映,使用Myc標(biāo)簽抗體進(jìn)行免疫共沉淀,檢測(cè)TR1M31對(duì)MAVS進(jìn)行invitro泛素化的狀況及泛素化形式。8.TRIM31通過(guò)E3連接酶活性影響RLR信號(hào)通路構(gòu)建TRIM31泛素連接酶功效缺失點(diǎn)突變載體,運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù),WesternBlotting技術(shù)檢測(cè)TRIM31泛素連接酶功效缺失后對(duì)RLR信號(hào)通路介導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生的影響,對(duì)病毒復(fù)制的影響,對(duì)MAVS泛素化的影響,以及對(duì)MAVS多聚化形成的影響。9.基因恢復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明證明TRIM31通過(guò)泛素化MAVS影響RLR介導(dǎo)的信號(hào)通路提取TRIM31缺點(diǎn)MEF細(xì)胞,分別轉(zhuǎn)染空對(duì)照載體、野生型TRIM31過(guò)體現(xiàn)載體及E3泛素連接酶功效缺失點(diǎn)突變過(guò)體現(xiàn)載體,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù),WesternBlotting技術(shù)檢測(cè)特異性恢復(fù)TRIM31基因體現(xiàn)后對(duì)IFN-β產(chǎn)生的影響,對(duì)病毒復(fù)制的影響,對(duì)MAVS泛素化的影響,以及對(duì)MAVS多聚化形成的影響。10.TRIM31對(duì)MAVS形成朊蛋白樣多聚體的影響轉(zhuǎn)染TRIM31過(guò)體現(xiàn)載體于HEK293T細(xì)胞系,或者用TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞,SeV感染不同時(shí)間點(diǎn)后,提取細(xì)胞線(xiàn)粒體,直接運(yùn)用SDD-AGE辦法檢測(cè)TRIM31過(guò)體現(xiàn)或者缺失后對(duì)MAVS朊蛋白樣多聚體形成的影響;或者將提取的SeV預(yù)刺激的線(xiàn)粒體進(jìn)行體外泛素化修飾,反映結(jié)束后,再SDD-AGE辦法檢測(cè)TRIM31對(duì)MAVS體外朊蛋白樣多聚體形成的影響。三.實(shí)驗(yàn)成果1.RNA病毒感染介導(dǎo)TRIM31募集到線(xiàn)粒體上有文獻(xiàn)報(bào)道,TRIM31分布于線(xiàn)粒體上及細(xì)胞漿中,為了進(jìn)一步研究RNA病毒感染與否影響TRIM31在線(xiàn)粒體的定位,我們將含有GFP標(biāo)簽的TRIM31過(guò)體現(xiàn)載體轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中,培養(yǎng)24小吋后,再感染SeV6小時(shí),運(yùn)用線(xiàn)粒體標(biāo)記蛋白作為參考,免疫熒光技術(shù)觀察TRIM31在線(xiàn)粒體上的定位狀況。我們發(fā)現(xiàn)SeV病毒感染介導(dǎo)了TRIM31向線(xiàn)粒體上募集。提取C57BL/6小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞,SeV感染不同吋間點(diǎn)后,提取線(xiàn)粒體蛋白,用WesternBlotting辦法檢測(cè)TRIM31在線(xiàn)粒體上的含量,我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞SeV病毒感染后,定位于線(xiàn)粒體上TRIM31蛋白含量明顯增加。以上成果提示我們RNA病毒感染會(huì)引發(fā)TRIM31向線(xiàn)粒體的募集。2.TRIM31正向調(diào)控RLR介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生進(jìn)而增強(qiáng)天然免疫抗病毒反映2.1TRIM31過(guò)體現(xiàn)增進(jìn)RNA病毒介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生為了探究TRIM31與否影響RLR信號(hào)通路,在HEK293T細(xì)胞或Hela細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Flag標(biāo)簽的TRIM31過(guò)體現(xiàn)載體,培養(yǎng)24小時(shí)后,SeV分別感染4小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)或轉(zhuǎn)染poly(I:C)6小時(shí)、12小時(shí),實(shí)時(shí)熒光定量PCR的辦法檢測(cè)IFN-βmRNA水平的變化,我們發(fā)現(xiàn)TRIM31過(guò)體現(xiàn)后,SeV感染及poly(I:C)轉(zhuǎn)染引發(fā)的IFN-βmRNA水平明顯升高。這預(yù)示著TRIM31正向調(diào)控RLR所介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生。2.2TRIM31干擾克制RNA病毒介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生。為了進(jìn)一步明確TRIM31在RLR信號(hào)通路所起的作用,我們合成了TRIM31小鼠源和人源的小干擾RNA,提取小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞,用轉(zhuǎn)染小干擾的辦法將減少TRIM31的體現(xiàn),SeV分別感染4小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí),實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)和ELISA技術(shù)檢測(cè)IFN-β3產(chǎn)生及分泌。成果顯示,TRIM31干擾后,SeV感染所介導(dǎo)的IFN-β的在mRNA水平及分泌水平都出現(xiàn)明顯下降,這進(jìn)一步證明了TRIM31能夠正向調(diào)控RLR所介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生。2.3TRIM31的抗病毒作用為了研究TRIM31對(duì)機(jī)體的抗病毒作用,轉(zhuǎn)染TRIM31特異性小干擾RNA或者TRIM31過(guò)體現(xiàn)載體于HEK293T細(xì)胞系,掊養(yǎng)24小時(shí)候,用含有綠色熒光蛋白的VSV-GFP進(jìn)行感染,實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)IFN-β的產(chǎn)生和VSVmRNA水平的變化;運(yùn)用熒光顯微鏡直接觀察病毒的復(fù)制狀況;收集細(xì)胞上清,進(jìn)行病毒空斑實(shí)驗(yàn)檢測(cè)病毒滴度。我們發(fā)現(xiàn)TRIM31十?dāng)_后,VSV感染引發(fā)IFN-βmRNA水平體現(xiàn)明顯下降,進(jìn)而使得VSV病毒逃逸并大量復(fù)制。病毒空斑實(shí)驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)TRIM31干擾組中VSV病毒滴度明顯升高。相反的,過(guò)體現(xiàn)TRIM31之后,VSV介導(dǎo)的IFN-βmRNA水平的產(chǎn)生明顯升高,VSV病毒mRNA水平明顯下降,熒光顯微鏡觀察病毒的復(fù)制能力削弱,病毒空斑實(shí)驗(yàn)證明TRIM31過(guò)體現(xiàn)組的VSV病毒滴度明顯下降。由此我們能夠看到TRIM31在機(jī)體抗病毒中起著十分重要的作用。3.TRIM31抗病毒的生理意義3.1TRIM31缺點(diǎn)克制RNA病毒引發(fā)的IFN-β產(chǎn)生為了進(jìn)一步驗(yàn)證TRIM31在RLR信號(hào)通路中所起的作用及TRIM31抗病毒的生理意義,我們構(gòu)建了TRIM31特異性敲基因小鼠,提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞,分別使用LPS、Poly(I:C)等TLR通路配體刺激細(xì)胞,SeV、VSV等RLR通路配體感染細(xì)胞,HSV-1等DNA配體感染細(xì)胞,實(shí)時(shí)熒光定量PCR辦法檢測(cè)IFN-β及IFN有關(guān)基因ISGs的體現(xiàn)差別,我們發(fā)現(xiàn)SeV感染或5’ppp-RNA轉(zhuǎn)染后,TRIM31敲基因小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞所體現(xiàn)的IFN-β以及IFN-β有關(guān)基因如Cc15、Cxc110的體現(xiàn)明顯下降。而使用LPS、Poly(I:C)刺激或HSV-1感染的野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞所體現(xiàn)的IFN-β以及IFN-β有關(guān)基因無(wú)明顯變化差別。我們分別提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞或者骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞,重復(fù)上面的實(shí)驗(yàn),得到相似的結(jié)論。這闡明TRIM31特異性敲除能夠明顯克制RNA病毒介導(dǎo)的I型干擾素的生成,而對(duì)TLR信號(hào)通路等沒(méi)有影響。3.2TRIM31敲基因小鼠更易于感染RNA病毒由于Ⅰ型干擾素與病毒的復(fù)制、去除有著直接關(guān)系,我們進(jìn)一步研究了TRIM31在機(jī)體抵抗病毒復(fù)制方面的生理意義,提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞,然后用VSV或HSV-1進(jìn)行感染,實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)IFN-β和VSV在mRNA水平的變化;收集細(xì)胞上清,運(yùn)用病毒空斑實(shí)驗(yàn)檢測(cè)病毒滴度差別。收取細(xì)胞蛋白,WesternBlotting辦法檢測(cè)VSV蛋白水平的體現(xiàn)差別。我們發(fā)現(xiàn)與野生小鼠相比較,TRIM31敲基因小鼠被VSV感染后產(chǎn)生IFN-β在mRNA水平明顯下降,而VSV在mRNA水平則明顯升高;病毒空斑實(shí)驗(yàn)顯示TRIM31敲基因小鼠VSV病毒滴度明顯升高。我們通過(guò)腹腔注射VSV病毒的辦法建立小鼠的RNA病毒感染模型,觀察小鼠的死亡率,繪制小鼠生存曲線(xiàn),發(fā)現(xiàn)TRIM31敲基因小鼠在病毒感染后的死亡率史高;小鼠眼球取血得到血清,ELISA辦法檢測(cè)TRIM31敲基因小鼠感染后血清中IFN-β的產(chǎn)量明顯低于野生型小鼠;處死小鼠后取肝臟、脾臟和肺臟,提取組織總RNA和蛋白,實(shí)時(shí)熒光定量PCR辦法檢測(cè)到TRIM31敲基因小鼠感染后的肝臟、脾臟和肺臟中IFN-β3的體現(xiàn)明顯低于野生型小鼠,而VSV的mRNA則明顯高于野生型小鼠;WesternBlotting辦法檢測(cè)同樣發(fā)現(xiàn)TRIM31敲基因小鼠感染后各組織中VsV蛋白含量也是明顯高于野生型小鼠;肝臟、脾臟和肺臟等組織研磨得到上清,病毒空斑實(shí)驗(yàn)檢測(cè)病毒滴度,發(fā)現(xiàn)TRIM31敲基因小鼠感染后的病毒滴度明顯高于野生型小鼠;取小鼠肺臟組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)及HE染色,觀察肺損傷狀況,發(fā)現(xiàn)TRIM31敲基因小鼠病毒感染后肺損傷比野生型小鼠更加嚴(yán)重。以上成果闡明相比于野生型小鼠,TRIM31敲基因小鼠更容易感染RNA病毒。我們通過(guò)腹腔注射HSV-1病毒的辦法建立小鼠的DNA病毒感染模型重復(fù)以上實(shí)驗(yàn),則發(fā)現(xiàn),野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠在抵抗DNA病毒的過(guò)程中沒(méi)有明顯的差別。4.TRIM31對(duì)RLR信號(hào)通路活化的影響RLR信號(hào)通路活化后能夠引發(fā)TBK1的本身磷酸化及激酶活性的激活,進(jìn)而引發(fā)IRF3的磷酸化,磷酸化后的IRF3發(fā)生二聚化并入核,結(jié)合到IFN的啟動(dòng)子區(qū)域,引發(fā)IFN-β的產(chǎn)生。因此,TBK1的磷酸化及IRF3的磷酸化、二聚化、入核代表RLR信號(hào)通路的活化。我們轉(zhuǎn)染TRIM31過(guò)體現(xiàn)載體于HEK293T細(xì)胞系,分別用SeV感染4小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí),WesternBlotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TRIM31過(guò)體現(xiàn)后病毒介導(dǎo)的TBK-1和IRF3磷酸化明顯增強(qiáng),IRF3進(jìn)入細(xì)胞核中的含量也明顯增加,運(yùn)用非變性WesternBlotting發(fā)現(xiàn)過(guò)體現(xiàn)TRIM31能夠增進(jìn)病毒介導(dǎo)的IRF3二聚體的形成。運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)檢測(cè)IRF3活性的變化,將IRF3的報(bào)告基因與TRIM31過(guò)體現(xiàn)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T,SeV感染后,我們發(fā)現(xiàn)過(guò)體現(xiàn)TRIM31明顯增進(jìn)病毒介導(dǎo)的IRF3的報(bào)告基因的活性。運(yùn)用DNA病毒HSV-1感染細(xì)胞,運(yùn)用以上手段發(fā)現(xiàn)TRIM31過(guò)體現(xiàn)并未影響DNA病毒介導(dǎo)的TBK1、IRF3的磷酸化。提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞,分別用SeV感染細(xì)胞,WesternBlotting檢測(cè)手段發(fā)觀TRIM31敲除后SeV介導(dǎo)的TBK-1和IRF3磷酸化明顯削弱,IRF3進(jìn)入細(xì)胞核中的含量也明顯減少,運(yùn)用非變性WesternBlotting發(fā)現(xiàn)TRIM31敲除能夠克制IRF3一聚體的形成。運(yùn)用DNA病毒HSV-1感染細(xì)胞,重復(fù)上述實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)HSV-1介導(dǎo)的TBK1及IRF3的活化并未受到影響。以上成果從多個(gè)層次闡明TRIM31特異性增進(jìn)RLR信號(hào)通路的活化,而對(duì)DNA病毒介導(dǎo)的信號(hào)通路活化沒(méi)有影響。5.TRIM31靶分子的尋找前面成果表明TRIM31增進(jìn)RNA病毒引發(fā)的IFN-β的產(chǎn)生,對(duì)病毒的復(fù)制起著明顯的克制作用。那么TRIM31是如何影響RLR所介導(dǎo)的信號(hào)通路的,具體的作用靶點(diǎn)是什么。接下來(lái),我們將RLR信號(hào)通路中有關(guān)的接頭分子RIG-I、MDA5、MAVS、TBK1、IKKε、1RF3-5D等接頭蛋白的過(guò)體現(xiàn)載體與TRIM31體現(xiàn)載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞系,運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)檢測(cè)TRIM31對(duì)不同接頭蛋白所介導(dǎo)的IFN-βmRNA產(chǎn)生及報(bào)告基因活性的影響,我們發(fā)現(xiàn)TRIM31過(guò)體現(xiàn)明顯能夠增進(jìn)RIG-I、MDA5、MAVS接頭蛋白所介導(dǎo)的IFN-β3mRNA的產(chǎn)生以及IFN-β報(bào)告基因活性,而對(duì)接頭TBK1、IKKε、IRF3-5D介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生沒(méi)有影響。結(jié)合之前我們發(fā)現(xiàn)TRIM31在RNA病毒感染后能夠募集到線(xiàn)粒體上的現(xiàn)象,提示我們TRIM31作用靶點(diǎn)有可能是MAVS。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一假設(shè),我們將RIG-I、MDA5、MAVS、TBK1、IKKε、IRF3-5D等接頭蛋白的過(guò)體現(xiàn)載體與TRIM31過(guò)體現(xiàn)載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞系,免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TRIM31與各接頭分子的結(jié)合狀況,成果顯示TRIM31與MAVS有明顯結(jié)合作用,而與其它接頭分子沒(méi)有結(jié)合作用。因此我們得出結(jié)論TRIM31可能通過(guò)靶向MAVS進(jìn)而調(diào)控RLR所介導(dǎo)的信號(hào)通路。6.TRIM31的coiled-coil構(gòu)造域與MAVS的proline-rich構(gòu)造域相結(jié)合為了更加細(xì)致進(jìn)一步的研究TRIM31與MAVS的結(jié)合狀況,我們進(jìn)一步檢測(cè)了它們內(nèi)源性的結(jié)合狀況,提取小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞,SeV感染不同時(shí)間點(diǎn),用內(nèi)源性TRIM31抗體進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),檢測(cè)內(nèi)源性TRIM31與MAVS的結(jié)合,我們觀察到隨著病毒感染時(shí)間的增加,TRIM31與MAVS結(jié)合也逐步增強(qiáng),兩者的結(jié)合存在時(shí)間依賴(lài)性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證兩者與否是直接性結(jié)合,我們運(yùn)用體外翻譯系統(tǒng),過(guò)體現(xiàn)TRIM31與MAVS的蛋白,免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)外源性體現(xiàn)TRIM31與MAVS發(fā)生了直接結(jié)合。為了探究TRIM31與MAVS發(fā)生結(jié)合的具體構(gòu)造域,我們構(gòu)建了一系列TRIM31與MAVS的截?cái)嗤蛔凅w,將各截?cái)囿w共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞系,免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TRIM31與MAVS的截?cái)嗤蛔凅w的結(jié)合狀況,實(shí)驗(yàn)表明TRIM31的coiled-coil構(gòu)造域與MAVS的proline-rich構(gòu)造域在TRIM31與MAVS的結(jié)合過(guò)程中起著重要的作用。7.TRIM31對(duì)MAVS的泛素化實(shí)驗(yàn)TRIM31屬于TRIM家族,是E3泛素連接酶的一種,因此我們想進(jìn)一步明確TRIM31對(duì)MAVS與否進(jìn)行了泛素化修飾。我們將Flag標(biāo)簽的TRIM31過(guò)體現(xiàn)載體,Myc標(biāo)簽MAVS過(guò)體現(xiàn)載體和HA標(biāo)簽的泛素體現(xiàn)載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞系,培養(yǎng)24小時(shí)后提取蛋白,用Myc特異性抗體進(jìn)行免疫共沉淀,WesternBlotting成果顯示TRIM31能夠增進(jìn)MAVS的K63位泛素化修飾。MAVS分子上共有14個(gè)賴(lài)氨酸位點(diǎn),為了具體闡明TRIM31對(duì)其中哪個(gè)氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行了泛素化修飾,我們構(gòu)建了一系列MAVS賴(lài)氨酸點(diǎn)突變過(guò)體現(xiàn)載體,與TRIM31過(guò)體現(xiàn)載體及泛素過(guò)體現(xiàn)載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞系,免疫共沉淀技術(shù)及WesternBlotting技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)TRIM31重要將MAVS上的第10位,第311位,第461位賴(lài)氨酸進(jìn)行K63位泛素化修飾。提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞,SeV感染不同時(shí)間點(diǎn),提取細(xì)胞蛋白,運(yùn)用MAVS內(nèi)源性抗體進(jìn)行免疫共沉淀,WesternBlotting技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TRIM31敲除后SeV介導(dǎo)的MAVS內(nèi)源性K63位泛素化水平明顯下降,而TRIM31對(duì)MAVS的K48位泛素化修飾無(wú)明顯影響。我們進(jìn)一步通過(guò)體外蛋白翻譯系統(tǒng)和體外泛素化系統(tǒng),檢測(cè)TRIM31對(duì)MVAS的體外泛素化修飾狀況,成果表明TRIM31能夠在體外系統(tǒng)直接增進(jìn)MAVS的K63位泛素化修飾。以上成果表明,E3泛素連接酶TRIM31能夠?qū)AVS的第10位,第311位,第461位賴(lài)氨酸進(jìn)行K63位泛素化修飾。8.TRIM31通過(guò)其E3泛素連接酶功效對(duì)RLR信號(hào)通路的影響為了進(jìn)一步驗(yàn)證TRIM31與否通過(guò)其E3泛素連接酶功效影響RLR信號(hào)通路,我們構(gòu)建了TRIM31泛素連接酶功效缺失點(diǎn)突變過(guò)體現(xiàn)載體,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)、雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)、WesternBlotting技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)缺失了E3泛素連接酶功效后,TRIM31對(duì)RLR信號(hào)通路介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生失去了增進(jìn)作用,TRIM31的抗病毒作用也隨即消失。以上結(jié)論闡明TRIM31通過(guò)其E3泛素連接酶活性增進(jìn)RLR介導(dǎo)的I型干擾素的產(chǎn)生及抗病毒作用。9.TRIM31增進(jìn)MAVS的多聚化TRIM31對(duì)MAVS進(jìn)行K63位泛素化修飾的機(jī)制我們已做了大量研究,然而TRIM31對(duì)MAVS修飾后如何調(diào)控MAVS的功效是我們進(jìn)一步要探討的重要問(wèn)題。已有文章報(bào)道MAVS在RNA病毒感染后形成朊蛋白樣多聚體,該多聚體的形成對(duì)于MAVS進(jìn)一步活化下·游信號(hào)通路起到至關(guān)重要的作用,然而MAVS如何形成朊蛋白白樣多聚體還不得而知。因此我們進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證TRIM31對(duì)MAVS的K63泛素化修飾與否增進(jìn)MAVS多聚體的形成。我們分別轉(zhuǎn)染空載體及TRIM31過(guò)體現(xiàn)載體于HEK293T細(xì)胞系,SeV感染不同時(shí)間點(diǎn)后,提取細(xì)胞線(xiàn)粒體,運(yùn)用SDD-AGE技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TRIM31過(guò)體現(xiàn)明顯增進(jìn)SeV介導(dǎo)的MAVS多聚體的形成。我們進(jìn)一步提取SeV預(yù)刺激后巨噬細(xì)胞的線(xiàn)粒體,與體外翻譯得到的TRIM31蛋白共同加入體外泛素化系統(tǒng),反映結(jié)束后,SDD-AGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TRIM31體外明顯增進(jìn)SeV介導(dǎo)的MAVS多聚體的形成。提取野生型小鼠和TRIM31敲基因小鼠的腹腔原代巨噬細(xì)胞,SeV感染不同時(shí)間點(diǎn),提取線(xiàn)粒體蛋白,SDD-AGE技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TRIM31敲除后明顯克制SeV介導(dǎo)的MAVS多聚體的形成。以上實(shí)驗(yàn)表明TRIM31能夠增進(jìn)MAVS朊蛋白樣多聚化的形成,進(jìn)而影響MAVS的活化及IFN-β的產(chǎn)生。10.基因恢復(fù)實(shí)驗(yàn)證明TRIM31特異性調(diào)控MAVS活化及RLR介導(dǎo)的信號(hào)通路我們提取TRIM31敲基因小鼠MEF細(xì)胞,分別轉(zhuǎn)染空載體及TRIM31過(guò)體現(xiàn)載體,SeV或VSV感染細(xì)胞,分別使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù),ELISA技術(shù),WesternBlotting技術(shù)進(jìn)行檢測(cè),我們發(fā)現(xiàn)TRIM31基因敲除后SeV誘導(dǎo)的MAVS形成朊蛋白樣多聚體的能力削弱,IFN-β產(chǎn)生減少,病毒復(fù)制明顯增加;重新過(guò)體現(xiàn)TRIM31后,由TRIM31缺點(diǎn)造成的對(duì)RLR信號(hào)通路及病毒復(fù)制的影響隨即消失。以上成果進(jìn)一步證明了