hplc同時(shí)測(cè)定梔子中8個(gè)環(huán)烯醚苷類(lèi)成分的含量

hplc同時(shí)測(cè)定梔子中8個(gè)環(huán)烯醚苷類(lèi)成分的含量

梔子來(lái)源于水生百合科植物。它具有凈化火焰、消除不適、清熱、解毒、消除腫脹和緩解疼痛的功效。梔子資源廣泛分布于長(zhǎng)江以南各省區(qū),主產(chǎn)于江西、湖北、湖南、浙江等地。以梔子苷為代表的環(huán)烯醚萜苷類(lèi)化合物為其主要成分,該類(lèi)成分具有保肝、利膽、解痙、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、降血糖血脂等多種藥理活性。目前市場(chǎng)上流通的梔子藥材,因受產(chǎn)地來(lái)源、采收時(shí)間、貯藏年限及基源植物等因素的影響,質(zhì)量參差不齊,甚者以偽充真,嚴(yán)重影響了藥材及其相關(guān)制劑的臨床藥效。而2010年版《中國(guó)藥典》僅以梔子苷作為梔子質(zhì)量控制的唯一含量測(cè)定指標(biāo),未能真實(shí)、全面地反映出梔子藥材的內(nèi)在質(zhì)量;相關(guān)文獻(xiàn)在梔子化學(xué)成分的含量測(cè)定及控制上,亦僅測(cè)定包括梔子苷在內(nèi)的1~2個(gè)成分的含量,本研究通過(guò)建立同時(shí)測(cè)定梔子中包括梔子苷在內(nèi)的8個(gè)主要環(huán)烯醚萜苷類(lèi)成分的HPLC,為進(jìn)一步完善梔子質(zhì)量控制與品質(zhì)評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。1含量測(cè)定儀器Agilent1100液相色譜儀(包括AgilentChemstation工作站,美國(guó)Agilent公司);AG285型電子分析天平(瑞士MettlerToledo公司),中藥粉碎機(jī)(DFT-100,溫嶺市大德中藥機(jī)械有限公司),KQ5200DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司,160W,40kHz)。所用對(duì)照品均為本實(shí)驗(yàn)室從梔子藥材中分離、鑒定,經(jīng)HPLC面積歸一化法測(cè)定純度均達(dá)98%以上,可供含量測(cè)定用。乙腈為色譜純,水為超純水,其余試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)材料于2010—2011年分別采集于江西各地及購(gòu)自安徽亳州,共計(jì)10個(gè)樣品,經(jīng)魯南制藥閆光軍高級(jí)工程師鑒定,均為茜草科梔子G.jasminoides的干燥成熟果實(shí),憑證標(biāo)本保存于魯南制藥中藥制藥共性技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,見(jiàn)表1。2方法和結(jié)果2.1對(duì)照品貯備液的制備分別精密稱(chēng)取梔子苷0.5012g,梔子新苷0.1064g,山梔苷0.1038g,梔子苷酸0.0248g,去乙酰車(chē)葉草苷酸甲酯0.1166g,羥異梔子苷0.1032g,雞矢藤次苷甲酯0.0510g,京尼平龍膽二糖苷0.1164g置50mL量瓶中,用50%甲醇溶解并定容至刻度,即得梔子苷10.0240g·L-1,梔子新苷2.1280g·L-1,山梔苷2.0760g·L-1,梔子苷酸0.4960g·L-1,去乙酰車(chē)葉草苷酸甲酯2.3320g·L-1,羥異梔子苷2.0640g·L-1,雞矢藤次苷甲酯1.0200g·L-1,京尼平龍膽二糖苷2.3280g·L-1的對(duì)照品貯備液。分別精密吸取7.5mL梔子苷,1.0mL梔子新苷,2.5mL山梔苷,1.0mL梔子苷酸,0.5mL去乙酰車(chē)葉草苷酸甲酯,10.0mL羥異梔子苷,1.0mL雞矢藤次苷甲酯和10.0mL京尼平龍膽二糖苷對(duì)照品貯備液,置50mL量瓶中,用超純水定容至刻度,即得混合對(duì)照品溶液。2.2超聲處理法取干燥藥材粉碎,過(guò)4號(hào)篩。取藥材粉末約0.5g,精密稱(chēng)定,置具塞錐形瓶中,精密加入50%甲醇25mL,密塞,稱(chēng)定質(zhì)量,超聲處理30min,放冷,用50%甲醇補(bǔ)足失重,搖勻,濾過(guò)。取續(xù)濾液適量,用0.45μm微孔濾膜濾過(guò),即得。2.3檢測(cè)波長(zhǎng)和溫度采用KromasilC18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm),流動(dòng)相為乙腈-水-三氟乙酸(6∶94∶0.05),流速1.0mL·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)238nm,柱溫40℃,進(jìn)樣量5μL。在該色譜條件下,梔子苷、梔子新苷、山梔苷、梔子苷酸、去乙酰車(chē)葉草苷酸甲酯、羥異梔子苷、雞矢藤次苷甲酯和京尼平龍膽二糖苷8個(gè)成分與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5,對(duì)稱(chēng)因子均在0.90~1.10,見(jiàn)圖1。2.4色譜條件的測(cè)定精密吸取2.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1,2,4,6,8,10μL,分別注入液相色譜儀,按2.3項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),計(jì)算回歸方程,見(jiàn)表2。2.5加樣回復(fù)合成高效的rsd精密吸取2.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液5μL,于同一天和3d內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣,測(cè)定梔子苷、梔子新苷、山梔苷、梔子苷酸、去乙酰車(chē)葉草苷酸甲酯、羥異梔子苷、雞矢藤次苷甲酯和京尼平龍膽二糖苷8個(gè)環(huán)烯醚萜苷類(lèi)成分的峰面積,計(jì)算RSD。結(jié)果日內(nèi)精密度,各成分峰面積的RSD(n=6)分別為0.040%,0.20%,0.090%,1.7%,0.14%,0.090%,0.61%,0.090%;日間精密度各成分峰面積的RSD(n=6)分別為0.10%,0.17%,0.080%,1.9%,0.18%,0.16%,0.54%,0.22%。日內(nèi)、日間精密度均RSD≤2.0%,表明該方法的日內(nèi)和日間精密度均良好。2.6去乙酰車(chē)葉草苷酸甲酯、羥異梔子苷,雞佐藤酯和京尼平龍膽二糖苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)取同一樣品6份,按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,進(jìn)樣測(cè)定峰面積,計(jì)算梔子苷、梔子新苷、山梔苷、梔子苷酸、去乙酰車(chē)葉草苷酸甲酯、羥異梔子苷、雞矢藤次苷甲酯和京尼平龍膽二糖苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)(n=6)分別為63.31,1.31,2.56,0.26,0.63,8.90,0.88,9.40mg·g-1,RSD分別為0.52%,0.49%,0.58%,1.4%,1.2%,0.68%,2.0%和0.72%。表明方法重復(fù)性良好。2.7不同種類(lèi)梔子新苷、山類(lèi)、香港梔子苷酸、去乙酰車(chē)葉草苷酸甲酯和京尼平龍膽二糖苷峰面積的rsdn取同一供試品溶液,分別于制備后0,2,4,6,8,10h進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得梔子苷、梔子新苷、山梔苷、梔子苷酸、去乙酰車(chē)葉草苷酸甲酯、羥異梔子苷、雞矢藤次苷甲酯和京尼平龍膽二糖苷峰面積的RSD(n=6)分別為0.66%,0.63%,0.61%,1.9%,0.69%,0.79%,1.3%,1.1%。表明供試品溶液在10h內(nèi)穩(wěn)定。2.8加樣回收率試驗(yàn)取2.6項(xiàng)下已知含量樣品粉末(過(guò)4號(hào)篩)6份,每份約0.25g,精密稱(chēng)定,置具塞錐形瓶中,加入梔子苷、梔子新苷、山梔苷、梔子苷酸、去乙酰車(chē)葉草苷酸甲酯、羥異梔子苷、雞矢藤次苷甲酯和京尼平龍膽二糖苷對(duì)照品溶液適量,按2.2項(xiàng)下梔子藥材供試品制備方法制備,進(jìn)樣5μL,計(jì)算各對(duì)照品的平均加樣回收率和RSD。結(jié)果梔子中上述8個(gè)環(huán)烯醚萜苷類(lèi)成分的平均加樣回收率在98.72%~101.2%,RSD均≤3.2%,表明該方法的準(zhǔn)確度良好,見(jiàn)表3。2.9樣品測(cè)定分別精密稱(chēng)取各梔子樣品約0.5g,按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按2.3項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,以外標(biāo)法計(jì)算質(zhì)量分?jǐn)?shù),結(jié)果見(jiàn)表4。3梔子苷及其類(lèi)化品含量測(cè)定以梔子苷含量為指標(biāo),分別考察了甲醇、乙醇、50%甲醇3種提取溶劑,結(jié)果表明50%甲醇提取效果最好,與文獻(xiàn)報(bào)道相一致,其更能反映藥材中內(nèi)在成分的真實(shí)含量,故選用50%甲醇為供試品溶液制備的提取溶劑。參考文獻(xiàn),選擇了乙腈-酸水系統(tǒng)作為流動(dòng)相,在此基礎(chǔ)上比較了該系統(tǒng)的等度洗脫與梯度洗脫2種方式,結(jié)果表明雖然梯度洗脫出峰較快而節(jié)省時(shí)間,但二者在上述成分的分離度上并無(wú)明顯差別,且等度洗脫對(duì)儀器要求較低,分離效果較為理想,彼此并無(wú)峰形重疊,故以乙腈-酸水系統(tǒng)為流動(dòng)相,以等度洗脫方式進(jìn)行測(cè)定。采用本實(shí)驗(yàn)建立的色譜方法對(duì)10個(gè)不同來(lái)源的梔子藥材進(jìn)行了含量測(cè)定。結(jié)果顯示,梔子苷等8個(gè)指標(biāo)性成分之間含量差異較大,其中以梔子苷最高,為38.26~69.60mg·g-1;梔子苷酸最低,為0.28~1.27mg·g-1。在《中國(guó)藥典》2010年版中藥材梔子項(xiàng)下,以梔子苷為指標(biāo)性成分對(duì)其含量作出了相應(yīng)規(guī)定,結(jié)合本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),表明上述10個(gè)來(lái)源的梔子藥材中梔子苷含量均明顯高于藥典規(guī)定(藥典規(guī)定梔子苷不得少于1.8%),約為藥典規(guī)定的2~4倍,說(shuō)明現(xiàn)行藥典在梔子苷含量限定上存在偏低情況,未能真實(shí)反映出藥材本身質(zhì)量?jī)?yōu)劣差異,建議下版藥典能對(duì)其含量限定項(xiàng)進(jìn)行相應(yīng)修訂提高,使之更能客觀(guān)地反映藥材的質(zhì)量現(xiàn)狀。同時(shí)由表3可知,9號(hào)野生種樣品在梔子新苷、山梔苷、羥異梔子苷等3個(gè)成分含量及上述8個(gè)環(huán)烯醚萜苷類(lèi)成分總含量上均高于其他栽培種樣品,說(shuō)明野生種藥材質(zhì)量異于(或優(yōu)于)栽培種,具有一定的物質(zhì)基礎(chǔ)。筆者前期對(duì)梔子中的環(huán)烯醚萜苷類(lèi)成分進(jìn)行了系統(tǒng)分離,共得到梔子苷、梔子新苷、山