頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)油橄欖酒的香氣成分

頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)油橄欖酒的香氣成分

橄欖樹，又稱洋橄欖和齊丁樹，是世界著名的新鮮果樹和餐用樹。它來自地中海沿岸國家，種植了4000多年。我國從1956年開始陸續(xù)引種油橄欖,現(xiàn)種植面積約3萬公頃,主要集中在甘肅、四川等地,其中甘肅隴南地區(qū)被認(rèn)為是中國最適合種植油橄欖的地區(qū)。油橄欖果實(shí)主要用于榨取橄欖油,榨油后產(chǎn)生的果渣及果汁中含有糖、脂肪酸、三萜、多酚、黃酮等諸多有效成分,處理不當(dāng)既導(dǎo)致環(huán)境污染又造成資源浪費(fèi)。長期以來,國內(nèi)外學(xué)者研究了物理、化學(xué)、生物及多種方法相結(jié)合的廢料處理工藝,其中成本低、污染小的生物法應(yīng)用前景最廣,如Luis等研究了黑曲霉在廢棄果汁中發(fā)酵生產(chǎn)脂肪酶的工藝;國內(nèi)研究目前主要集中在果渣有效成分的提取上,果汁多作為廢水排放,相關(guān)研究較少。本實(shí)驗(yàn)以甘肅隴南地區(qū)經(jīng)壓榨制取橄欖油后的果汁為原料,通過調(diào)配及酒精發(fā)酵等工藝制得油橄欖果酒,并進(jìn)行了理化指標(biāo)、感官評(píng)價(jià)及香氣成分分析,旨在為油橄欖果實(shí)的高效利用,進(jìn)一步提高其附加值提供理論依據(jù),促進(jìn)我國油橄欖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。1材料和方法1.1原代試劑及試劑油橄欖果汁隴南天然居油橄欖科技開發(fā)有限公司;正辛醇、蘆丁(均為色譜純)美國Sigma公司;磷鉬鎢酸顯色劑北京華科盛精細(xì)化工產(chǎn)品貿(mào)易有限公司;無水乙醇、氯化鈉、偏重亞硫酸鉀、一水合沒食子酸、鹽酸、氫氧化鈉、硫酸、無水葡萄糖等試劑均為國產(chǎn)分析純;費(fèi)林溶液、次甲基藍(lán)指示液、酚酞指示液、碘標(biāo)準(zhǔn)滴定液、淀粉指示液等按照GB/T603—2002《化學(xué)試劑:試驗(yàn)方法中所用制劑及制品的制備》配制。1.2儀器、萃取裝置CP214電子天平上海奧豪斯儀器有限公司;HH-S型恒溫水浴鍋金壇市恒豐儀器制造有限公司;Genesis10s紫外-可見分光光度計(jì)、265079氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、TG-WAX色譜柱美國ThermoScientific公司;頂空固相微萃取裝置、DVB/Carboxen/PDMS(50/30μm)萃取器美國Surpelco公司;GZX-GF101-Ⅱ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;18100摩爾超純水機(jī)重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司;MSC-400磁力加熱攪拌器德國WiggenHauser公司;手持?jǐn)?shù)顯糖度計(jì)日本Atago公司;WKM-2-3三聯(lián)微孔膜過濾器煙臺(tái)一州科美機(jī)械科技有限公司。1.3方法1.3.1果汁ph的調(diào)整操作要點(diǎn):1)調(diào)配:果汁含糖量為75.7g/L,按照17g/L糖→體積分?jǐn)?shù)1%酒精加白砂糖進(jìn)行調(diào)配,使初始糖度為160g/L,添加SO2抑制雜菌(120mg/L偏重亞硫酸鉀),并用檸檬酸調(diào)整果汁pH值至4~4.5;2)酵母活化:取適量果汁水浴加熱至35℃后按推薦用量接入酵母,活化30min,待果汁冷卻至室溫后加入發(fā)酵罐中;3)發(fā)酵:22℃發(fā)酵,每天測(cè)定發(fā)酵液溫度及糖含量(手持?jǐn)?shù)顯糖度計(jì)測(cè)定),主發(fā)酵期結(jié)束后(糖度不再明顯降低)按40mg/L添加偏重亞硫酸鉀終止發(fā)酵;4)分離澄清:在10~15℃的酒窖中貯存,通過定期倒罐去除酒泥,并用40mg/L明膠對(duì)果酒進(jìn)行澄清處理;5)過濾裝瓶:按40mg/L添加偏重亞硫酸鉀,膜過濾機(jī)(濾膜孔徑分別為1、0.45μm和0.22μm)過濾后裝瓶貯存。1.3.2物理和化學(xué)指標(biāo)的測(cè)定1.3.2.測(cè)定指標(biāo)的通用分析方法參照GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測(cè)定酒精體積分?jǐn)?shù)(密度瓶法)、干浸出物含量、總糖含量、總酸含量(指示劑法)、揮發(fā)酸含量、總二氧化硫含量(直接碘量法)等指標(biāo)。1.3.2.吸光度測(cè)定油橄欖酒于0.45μm孔徑的濾紙過濾后測(cè)定pH值,用相同pH值的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液以1∶10(V/V)稀釋酒樣。取稀釋后的酒樣于1cm比色杯中,在分光光度計(jì)波長420、520nm和620nm條件下分別測(cè)定其吸光度。三者吸光度之和即為該酒樣色度值,前兩者比值為色調(diào)值。1.3.2.樣品的顯色率福林酚比色法:吸取2.0mL酒樣,用水稀釋至100mL,然后吸取1.0mL樣品溶液分別加入水5.0mL、福林酚顯色劑1mL和質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.5%碳酸鈉溶液3mL,顯色。放置2h后在765nm波長條件下測(cè)定樣品的吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(方程)計(jì)算出樣品中總酚的含量。1.3.2.4單因素測(cè)量參照NY/T1600—2008《水果、蔬菜及其制品中單寧含量的測(cè)定:分光光度法》測(cè)定。1.3.2.總黃酮含量的測(cè)定AlCl3顯色法:吸取2mL酒樣用體積分?jǐn)?shù)30%乙醇溶液稀釋至10mL,取1mL稀釋后的酒樣,加4mL體積分?jǐn)?shù)30%乙醇溶液,搖勻,再加4mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%AlCl3溶液,最后用體積分?jǐn)?shù)30%乙醇溶液稀釋至10mL,搖勻放置10min后在415nm波長條件下測(cè)定樣品吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(方程)計(jì)算出樣品中總黃酮的含量。1.3.3感官分析檢驗(yàn)在標(biāo)準(zhǔn)葡萄酒品嘗實(shí)驗(yàn)室中,由5位專家組成的感官分析品嘗小組參照GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》對(duì)該產(chǎn)品進(jìn)行感官分析。1.3.4分析氣體性質(zhì)1.3.4.固相微萃取-分離法在裝有磁力攪拌器的頂空瓶中加入5mL油橄欖酒、1.5gNaCl、50?L1-辛醇乙醇溶液(使其在最終酒樣中的質(zhì)量濃度為8.3mg/L),在45℃條件下恒溫?cái)嚢?0min后,用活化好的固相微萃取器吸附30min,氣相色譜進(jìn)樣口解吸溫度250℃,解吸時(shí)間10min,進(jìn)行分析。1.3.4.溫程序lg色譜柱:ThermoTG-WAX(60m×0.25mm,0.5μm);升溫程序:50℃保持5min,以5℃/min升至230℃,保持10min;不分流進(jìn)樣;電子電離(electronionization,EI)源;電子能量70eV;傳輸線溫度230℃;離子源溫度250℃;質(zhì)量掃描范圍m/z50~450。1.4定性定量比對(duì)實(shí)驗(yàn)定性:由GC-MS分析得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)計(jì)算機(jī)在NIST、Wiley及香精香料標(biāo)準(zhǔn)譜庫的檢索比對(duì)進(jìn)行定性,比對(duì)時(shí)要求匹配度大于800(最大值為1000);定量:采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行半定量分析,內(nèi)標(biāo)選用1-辛醇。2.2總酚、工藝總花色苷、蛇龍珠干葡萄酒色度值由表1可知,總二氧化硫含量、總糖含量(半干酒)、酒精體積分?jǐn)?shù)、揮發(fā)酸含量及干浸出物含量等指標(biāo)均符合國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定;總酚、單寧含量及色度值與蛇龍珠干紅葡萄酒相當(dāng)。色度值可用于衡量果酒的色澤品質(zhì),一般而言,總酚、單寧、總花色苷含量較高的果酒顏色深,色度值高,反之色度值則較低,但也受果酒SO2含量及pH值的影響。油橄欖酒中的黃酮類化合物主要有木犀草苷、蘆丁等,總含量約為31.65mg/L。2.3無法替代的作用感官分析是果酒品質(zhì)檢驗(yàn)的經(jīng)典方法,具有儀器分析無法替代的作用。感官分析結(jié)果表明,該果酒呈棕紅色,澄清透明,無沉淀及懸浮物,具有純正、優(yōu)雅的果香與酒香,口感較舒順、完整,有特殊的橄欖香。2.4半干果酒香氣物質(zhì)根據(jù)總離子流圖(圖3),油橄欖酒中初步鑒定出69種香氣化合物,總含量為23.44mg/L,其中醇類12種、酯類25種、有機(jī)酸6種、羰基化合物(醛和酮)8種、萜烯類14種、酚類4種,分別占總組分的27.78%、45.97%、5.80%、3.39%、8.86%和8.20%,各香氣物質(zhì)及其含量見表2。香氣成分是衡量果酒風(fēng)味品質(zhì)的主要指標(biāo),果酒的香氣來自果實(shí)本身、酵母發(fā)酵及陳釀等過程,其主要成分有酯、醇、萜烯、酚、縮醛、內(nèi)酯、脂肪酸等。各組分對(duì)香氣的貢獻(xiàn)取決于它們的濃度和閾值,根據(jù)OAV值并參考文獻(xiàn)報(bào)道,油橄欖酒中OAV值大于1的化合物有23種,初步確定主要香氣成分有香葉醇、苯甲酸乙酯、辛酸乙酯和愈創(chuàng)木酚。2.4.1油橄欖酒基酸及糖代謝產(chǎn)物的含量發(fā)酵階段可產(chǎn)生高級(jí)醇、酯和有機(jī)酸等主要香氣物質(zhì),根據(jù)定性定量結(jié)果,該階段形成的香氣物質(zhì)是酒最主要的香氣成分。高級(jí)醇是酵母酒精發(fā)酵過程中氨基酸或糖代謝的產(chǎn)物,其含量受發(fā)酵條件、醪液理化指標(biāo)及原料等因素的影響。油橄欖酒中含量最高的醇類物質(zhì)是異戊醇,其次是苯乙醇,它們都是果酒發(fā)酵中酵母的代謝產(chǎn)物,當(dāng)其質(zhì)量濃度分別高于300mg/L和140mg/L時(shí)會(huì)有腐臭味,低于此值則會(huì)給酒體帶來宜人的果香和花香。具有青草味和果香的1-己醇和順-3-己烯-1-醇是C6醛、醇類化合物,主要由橄欖油制取過程中多不飽和脂肪酸(亞油酸和亞麻酸)在脂氧合酶作用下產(chǎn)生。2.4.2酰氯的合成酰氧基化劑酯類的形成也受醪液理化組成及發(fā)酵條件的影響。酒精發(fā)酵階段,在酯酶催化作用下?；鵆oA與乙醇合成脂肪酸乙酯,乙酰CoA和高級(jí)醇合成乙酸酯。在該果酒所檢出的69種化合物中,酯類占25種,是種類最多的化合物。酯類化合物中乙酸乙酯含量最高,在較低濃度水平下,可增加酒體香氣的復(fù)雜性。具有氣味活性值的乙酸異戊酯、己酸乙酯和辛酸乙酯等低分子質(zhì)量酯類物質(zhì)由于具有水果的芳香味而常被稱為“水果”酯類。2.4.3具有設(shè)置應(yīng)當(dāng)觀賞的植物萜烯類化合物屬于植物體中由乙酰CoA合成的次級(jí)代謝產(chǎn)物,以游離態(tài)和無味的糖苷結(jié)合態(tài)存在于植物果實(shí)中,該類化合物具有濃郁的香味,且感官閾值較低,通常具有花香、果香、種子、木頭及根莖的氣味。油橄欖酒中初步鑒定出14種萜烯類化合物,與油橄欖果實(shí)及橄欖油中的報(bào)道相似,其中里那醇、香葉醇、異香茅醇和α-萜品醇有氣味活性值,賦予酒濃郁的花香和果香。2.4.4發(fā)酵酚類化合物油橄欖酒中還檢測(cè)到了有機(jī)酸、羰基化合物和揮發(fā)性酚類物質(zhì)等。盡管產(chǎn)品中鑒定出的有機(jī)酸含量都低于閾值,但這些酸仍可為酒帶來新鮮感并同時(shí)平衡果香。油橄欖酒中醛酮類化合物的種類少于果實(shí)和橄欖油,這可能是釀造過程中的損失及轉(zhuǎn)化所致,其機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。α-紫羅酮和β-紫羅酮為紫羅蘭香,在酒的香氣構(gòu)成中具有重要作用;β-大馬酮表現(xiàn)為花香和果香且閾值極低(6μg/L),對(duì)酒感官影響較大,但也有一些學(xué)者認(rèn)為其主要作用是增強(qiáng)果實(shí)中其他化合物的香氣,而非單獨(dú)呈味。果酒中的揮發(fā)性酚類物質(zhì)來源于果實(shí)本身或酒精發(fā)酵過程,由酚酸降解或酒香酵母產(chǎn)生。該果酒初步鑒定出的4種揮發(fā)性酚類物質(zhì)中,愈創(chuàng)木酚氣味活性值較高。3理化及香價(jià)分析結(jié)果3.1本實(shí)驗(yàn)以壓榨制取橄欖油后廢棄的果汁為原料,經(jīng)調(diào)配發(fā)酵制得油橄欖酒。所得產(chǎn)品酒精體積分?jǐn)?shù)(6.42%)、總糖含量(7.84g/L)、揮發(fā)酸含量(1.04g/L)、總二氧化硫含量(103.05mg/L)及干浸出物含量(