葡萄果汁乳酸發(fā)酵菌株的篩選及復(fù)配發(fā)酵對風(fēng)味物質(zhì)的影響

葡萄果汁乳酸發(fā)酵菌株的篩選及復(fù)配發(fā)酵對風(fēng)味物質(zhì)的影響

蘑菇是日本和美國等工業(yè)化國家成功開發(fā)的一些產(chǎn)品。然而，中國只有花卉、甘蔗、胡蘿卜、甜、南瓜、番茄和其他水果以原料為原料的實驗室研究報告，對葡萄果酸分解的研究很少，也很少關(guān)于腐敗和闡明水果引起的國內(nèi)外報道。為了在高度酸的果汁中發(fā)制酸，我們需要使用植物。它們必須適應(yīng)酸性環(huán)境，快速生長，并與果汁的性質(zhì)相協(xié)調(diào)?，F(xiàn)有的研究通常直接適用于乳科糖的常見良種。通常，在原料或擴展培養(yǎng)基中添加一定的粉末以開始果肉的分解，或僅限于中性或弱酸性發(fā)酵基質(zhì)。這種味道和水果的清新、優(yōu)雅風(fēng)格不協(xié)調(diào)，無法改善果汁的味道和營養(yǎng)功能。“貴葡1號”是南方種植的優(yōu)良加工品種，但果汁的ph值很高，達到0.5%-1.2%。根據(jù)之前對枇杷果肉發(fā)酵菌進行的初步研究，該實驗室選擇了適合葡萄糖果汁發(fā)酵的優(yōu)良菌株，并研究了單帶菌的復(fù)合發(fā)酵對果汁口感物質(zhì)的影響。為南方特色果園的深度加工提供新的領(lǐng)域和技術(shù)支持，為飲料市場提供具有功能因素的新鮮空氣發(fā)酵產(chǎn)品。1材料和方法1.1材料表面1.1.1果汁總酸、可溶性總糖的制備“桂葡1號”葡萄,福建省福安產(chǎn),果實經(jīng)去梗、破碎、護色、取汁,分裝在玻璃發(fā)酵瓶中加硅膠塞于沸水浴殺菌10min,冷卻備用.果汁總酸(以酒石酸計)0.60%,pH值3.32,可溶性總糖(以葡萄糖計)19.93%.1.1.2菌株的選育與保藏干酪乳桿菌20986、嗜熱鏈球菌20379,購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心;植物乳桿菌R23(LactobacillusplantarumR23)、干酪乳桿菌R35(LactobacilluscaseiR35)、副干酪乳桿菌副干酪亞種R37(LactobacillusparacaseiR37),本實驗室選育并保藏.各菌株的培養(yǎng)及發(fā)酵溫度均為28±1℃.1.1.3活菌的平板計數(shù)用于乳酸菌的液體保藏.TJA培養(yǎng)基:番茄汁50mL,酵母抽提液5g,牛肉膏10g,乳糖20g,葡萄糖2g,磷酸氫二鉀2g,吐溫801g,乙酸鈉5g,加蒸餾水至1L,pH值為6.8±0.2,121℃下滅菌20min,用于活菌的平板計數(shù).1.2實驗方法1.2.1葡萄汁添加合物的制備供試乳酸菌經(jīng)活化后,分別接種于液體培養(yǎng)基LH16,培養(yǎng)24h后至菌量達109CFU/mL,采用3000r/min、4℃離心10min,取菌坭加適量預(yù)處理葡萄汁振蕩懸浮,菌密度達到109CFU/mL以上,待用.1.2.2活菌計數(shù)lh8將1.2.1收集的乳酸菌菌坭用無菌生理鹽水洗滌2次,并以原體積的十分之一制成懸浮菌,以1%的接種量分別接種于pH值為2.5,3.0,3.5的LH18培養(yǎng)基中,28±1℃控溫培養(yǎng)4h,每2h取樣進行活菌計數(shù),平行3次取平均值.1.2.3評估方法：葡萄糖酸酸根的發(fā)酵風(fēng)格將1.2.1制備的種子液,分別以107CFU/mL的生物量接入葡萄果汁中,28℃控溫培養(yǎng),感官評判發(fā)酵風(fēng)味變化.1.2.4復(fù)配菌種生物量的確定將植物乳桿菌R23、副干酪乳桿菌副干酪亞種R37按1.2.1制備種子液,分別將2株單菌株,以及2菌株按接種體積比1∶1復(fù)配菌,按107CFU/mL的生物量接入葡萄全汁中,28±1℃控溫培養(yǎng),每12h檢測發(fā)酵果汁菌體生物量.1.2.5揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定將1.2.1制備的種子液,分別以107CFU/mL的生物量接入葡萄汁中,28±1℃控溫培養(yǎng),以未發(fā)酵葡萄果汁為對照,選取發(fā)酵風(fēng)味最佳時期進行感官評判,并定性檢測揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì).1.3檢測方法1.3.1樣品統(tǒng)計分析從果香、發(fā)酵香、滋味和典型性四個角度來考察,分別賦予20分,40分,20分,20分的權(quán)重,最后以各項的總和加權(quán)計算.請12個經(jīng)培訓(xùn)過的專業(yè)人士進行獨立打分,取平均值統(tǒng)計分析.發(fā)酵樣品按其得分分為5級.一級為90～100分,特點為有葡萄果香,發(fā)酵香濃郁,滋味好,風(fēng)格獨特,優(yōu)雅無缺;二級為80～89分,特點為有葡萄果香,發(fā)酵香較濃郁,滋味好,典型明確,風(fēng)格良好;三級為70～79分,特點為有葡萄果香,發(fā)酵香一般,滋味較好,有典型性,不夠怡雅;四級為60～69分,特點為葡萄果香淡,發(fā)酵香不明顯;五級分值小于60分,特點為香氣及滋味均不愉快.1.3.2總結(jié)一致測定參照GB/T4789.35—2003[食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗—乳酸菌飲料中乳酸菌檢驗],平板菌落計數(shù)法.1.3.3完善對蒸發(fā)味道物質(zhì)的測定方法1不同時點二氯甲烷的分離純化取200mL樣品,分別用100,50,30mL的重蒸2遍的二氯甲烷萃取3次,合并有機相,用無水硫酸鈉脫水干燥,濃縮至5mL,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1mL,-40℃保存.2色譜條件采用Agilent7980A/5975C型氣質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng),色譜柱HP-FFAP(改性聚乙二醇柱,極性)30m×0.25m×0.25mm.色譜條件:載氣He氣,進樣口溫度250℃,柱溫采用程序升溫,60℃保留5min,以5℃/min升至240℃,保留10min恒流(1mL/min),不分流進樣.質(zhì)譜條件:離子源溫度為230℃,四級桿溫度為150℃,電離方式為EI源.1.4壓力下xs各實驗重復(fù)3次,數(shù)據(jù)采用DPS軟件處理,表1是3次實驗的平均值,數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示;圖1至圖4及表2是其中一次典型實驗的測定和評價值,樣品中各未知揮發(fā)性成分經(jīng)NIST08譜庫檢索定性,定量分析采用面積歸一法.2結(jié)果與分析2.1生物及其產(chǎn)物對酸溫度的生長各菌株耐酸能力見表1.植物乳桿菌R23、副干酪乳桿菌副干酪亞種R37和干酪乳桿菌R35均能在pH值3.0的環(huán)境下維持生長,其中R23和R37在pH值2.5的環(huán)境下培養(yǎng)4h的生物量仍高于105CFU/mL,顯著高于其他各菌(P<0.01).干酪乳桿菌20986在pH值為2.5的環(huán)境下培養(yǎng)4h后生長受限,而嗜熱鏈球菌20379則全部死亡.結(jié)果表明,植物乳桿菌R23和副干酪乳桿菌副干酪亞種R37對高酸環(huán)境的耐受能力最強,適用于較高酸度果蔬汁的乳酸發(fā)酵.2.2副干酪乳桿菌對葡萄果汁乳酸發(fā)酵的影響葡萄果汁接種不同乳酸菌控溫培養(yǎng)過程的發(fā)酵風(fēng)味變化見圖1.不同發(fā)酵菌株均能賦予發(fā)酵基質(zhì)典型性的發(fā)酵香氣,參考陶永勝等對葡萄酒香氣特征描述,感官評價認(rèn)為植物乳桿菌R23含有淡雅綿長的白脫香,副干酪乳桿菌副干酪亞種R37賦予典型性突出的樹脂香,均與葡萄果香協(xié)調(diào),分別在發(fā)酵2d和3d獲得最佳發(fā)酵風(fēng)味,風(fēng)味值可達93～94分.嗜熱鏈球菌20379可能是因為對pH值為3.32葡萄全汁的高酸抗逆性較差,生長受到抑制,無法產(chǎn)生良好發(fā)酵風(fēng)味,干酪乳桿菌R35、干酪乳桿菌20986則產(chǎn)生了奶臭味或腐土味等與葡萄果香不協(xié)調(diào)的風(fēng)味.耐酸實驗(表1)和風(fēng)味評價(圖1)結(jié)果表明,植物乳桿菌R23和副干酪乳桿菌副干酪亞種R37應(yīng)用于葡萄果汁發(fā)酵,可生產(chǎn)與葡萄果香協(xié)調(diào)的愉快發(fā)酵香,是葡萄果汁乳酸發(fā)酵的優(yōu)良菌株.2.3復(fù)配菌生長特性植物乳桿菌R23、副干酪乳桿菌副干酪亞種R37的單菌株及其復(fù)配菌在葡萄果汁中的生長曲線見圖2.兩菌株及復(fù)配菌在葡萄果汁中均能快速進入對數(shù)增長期,生長穩(wěn)定期可維持120h以上,生長曲線均符合Gauss模型.實驗結(jié)果表明:兩菌株復(fù)配在葡萄汁中可共生發(fā)酵,其菌量對數(shù)值Y與發(fā)酵時間X的回歸方程為:Y=8.9482×(1-0.205279×EXP(-0.003087×X2)(F=193.2086,P<0.01).2.4復(fù)配菌在葡萄汁中的最佳風(fēng)味植物乳桿菌R23、副干酪乳桿菌副干酪亞種R37的單菌株及其復(fù)配菌的發(fā)酵風(fēng)味評分見圖3,最佳風(fēng)味收獲期的風(fēng)味值達93～96分,復(fù)合菌發(fā)酵糅合了兩單菌特點而更顯愉快飽滿,且與果香協(xié)調(diào).實驗結(jié)果表明:復(fù)配菌在葡萄汁中的發(fā)酵風(fēng)味集合了兩菌株各自特點而更具優(yōu)勢,具有理想應(yīng)用前景.2.5葡萄果汁發(fā)酵中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化采用GC-MS法定性檢測發(fā)酵及未發(fā)酵葡萄果汁揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的總離子流色譜圖見圖4,結(jié)果見表2.葡萄果汁以酯類和芳香族物質(zhì)為主,乳酸發(fā)酵主要增加了酸、酮、酯類物質(zhì)的相對含量比例,酚和酸有新增的組分.植物乳桿菌R23發(fā)酵產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)數(shù)量最多,各單株發(fā)酵及其復(fù)合菌發(fā)酵所產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成不同,形成各具特色的發(fā)酵風(fēng)味,其主要特征風(fēng)味物質(zhì)的定性定量分析鑒定待另文發(fā)表.3葡萄果汁乳酸發(fā)酵適宜菌株的篩選大部分水果的物性都偏酸,尤其是南方特色果品枇杷、葡萄等果汁的pH值往往低于4.0,有機酸豐富,而乳糖等碳源缺乏.現(xiàn)有研究多直接應(yīng)用酸奶發(fā)酵菌,添加乳粉或者人為降低果汁酸度,以啟動乳酸發(fā)酵,但破壞了果汁的自然風(fēng)味與滋味.本實驗室自選的植物乳桿菌R23與副干酪乳桿菌副干酪亞種R37均是MLF乳酸菌,具有耐酸能力好,可利用天然有機酸為碳源,發(fā)酵香與原果香協(xié)調(diào),增殖能力強等優(yōu)點,可獲得樹脂香型或淡雅白脫香的自然清爽乳酸發(fā)酵果汁,均是葡萄果汁乳酸發(fā)酵適宜菌株.不同乳酸菌發(fā)酵果汁產(chǎn)生的發(fā)酵風(fēng)味和滋味存在差異,能形成與原果香協(xié)調(diào)的發(fā)酵香的乳酸菌