固相微萃取結(jié)合全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜分析糟富集揮發(fā)性風(fēng)味成分

固相微萃取結(jié)合全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜分析糟富集揮發(fā)性風(fēng)味成分

這種優(yōu)質(zhì)魚類含有少量營養(yǎng)，具有益脾益血虛證的功效，在中國沿海地區(qū)廣泛分布。它是中國最大的經(jīng)濟魚類。大黃魚和小黃魚被稱為中國四大海洋產(chǎn)品。將帶魚經(jīng)過鹽腌、干燥和糟制等工序加工而成的糟帶魚是浙江地區(qū)的傳統(tǒng)水產(chǎn)加工品,具有甜咸和諧、醇香濃郁、回味悠長、口感柔和、色澤亮麗等風(fēng)味特點。食品風(fēng)味作為感官功能的重要組成部分,在很大程度上決定著食品的可接受性。食品風(fēng)味的研究對了解食品特征風(fēng)味組成和食品風(fēng)味品質(zhì)控制等方面有著重要意義,近年來備受重視,并促進了食品風(fēng)味分析檢測等相關(guān)技術(shù)的快速發(fā)展。固相微萃取技術(shù)(SPME)是Pawliszyn在1990年提出的一種快速、無溶劑的樣品前處理技術(shù),具有靈敏度高、檢測限低等特點,能夠用于不同樣品基質(zhì)的揮發(fā)性成分的萃取。全二維氣相色譜(ComprehensiveTwo-DimensionalGasChromatography,GC×GC)是20世紀90年代誕生的多維色譜分離技術(shù),與通常的一維氣相色譜相比,GC×GC具有分辨率高、峰容量大、靈敏度好、分析速度快、定性更準(zhǔn)確和信息量大等特點。飛行時間質(zhì)譜(TimeofFlightMassSpectrometry,TOFMS)的高采集頻率(最高可達500spectra/s)可以很好地檢測全二維氣相色譜流出的信號。SPME-GC×GC/TOFMS在國外食品風(fēng)味分析有一定的應(yīng)用,Welke等用HS-SPME-GC×GC/TOFMS分析檢測巴西梅樂葡萄酒中的揮發(fā)性成分,共鑒定出334種化合物;Silva等用50/30μmDVB/CAR/PDMS在海鹽中檢測出157種揮發(fā)性成分,并進行了分類;Perestrelo等用SPME-GC×GC/TOFMS在馬德拉酒中鑒定出103種揮發(fā)性化合物,并通過化合物的種類判斷酒的年份。國內(nèi)有關(guān)SPME-GC×GC/TOFMS的研究大都集中在石油成分分析,而對食品風(fēng)味的檢測分析大都采用普通的GC-MS技術(shù)。目前國內(nèi)對糟魚的研究主要集中在加工工藝的改進及對糟魚品質(zhì)控制的影響,對糟魚的風(fēng)味成分研究鮮有報道,也不夠深入,僅有2篇文章對新鮮帶魚、咸帶魚和干帶魚的風(fēng)味進行對比,主要是采用一維氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法對揮發(fā)性風(fēng)味成分進行初步鑒定。本試驗采用SPME-GC×GC/TOFMS技術(shù)對糟帶魚的揮發(fā)性風(fēng)味化合物進行定性研究,以期為糟魚風(fēng)味形成機理和品質(zhì)控制提供研究方法及理論依據(jù)。1固相微萃取裝置糟帶魚,購自浙江寧波某超市。全二維氣相色譜/飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)(Pegasus4D),由Agilent7890氣相色譜儀,美國Agilent公司;KT-2001型冷噴調(diào)制器(ZoexCorp,Lincoln,NE,USA)和PegasusⅢ型飛行時間質(zhì)譜儀(LecoCorporation,St.Joseph,MI,USA)組成。固相微萃取裝置配75μmCarboxen/PDMS、65μmPDMS/DVB、50/30μmDVB/CAR/PDMS萃取頭,美國Supelco公司;IKA?RCTbasic加熱型磁力攪拌器,德國IKA公司;7×15mmB型聚四氟乙烯磁力攪拌子;JJ-2組織搗碎勻漿機(武漢格萊莫檢測設(shè)備有限公司)。1.2測試方法1.2.1spmee-rosml試驗原料處理:用吸水紙將糟魚表面的糟液吸干,使用JJ-2組織搗碎勻漿機搗碎,裝入20mL螺口頂空瓶,置于零下20℃冰箱中備用。固相微萃取頭活化:75μmCAR/PDMS在300℃活化1h;65μmPDMS/DVB在250℃活化0.5h;50/30μmDVB/CAR/PDMS270℃活化1h;活化過程必須在高純氮氣流保護下進行。1.2.2萃取條件優(yōu)化稱取1g搗碎樣品裝入40mL螺口頂空瓶,加入5mL去離子水,研究不同的固相微萃取頭(75μmCAR/PDMS、65μmPDMS/DVB、50/30μmDVB/CAR/PDMS)、萃取時間(10、20、30、40、50min)、水浴萃取溫度(30、40、50、60℃)、氯化鈉添加量(0、10、20、30、40%)、磁力攪拌轉(zhuǎn)速(0、100、200、300、400r/min)對糟帶魚揮發(fā)性成分萃取效果的影響,優(yōu)化萃取條件。1.2.3色譜柱及調(diào)制器不分流手動進樣,恒流操作,流量1mL/min。進樣口溫度為250℃,SPME解析10min。柱系統(tǒng):采用非極性柱Rxi5silMs-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)作為第一維色譜柱,中等極性柱Rtx-200(1.79m×0.18mm×0.2μm)作為第二維色譜柱。程序升溫:主爐箱初始溫度50℃,保持2min,以4℃/min的升溫速率升至180℃,再以8℃/min升至300℃,保持5min。小爐箱以高于主爐箱5℃的溫度平行升溫,調(diào)制器補償溫度:10℃,調(diào)制周期為8s(熱吹1.2s,冷吹2.8s)。質(zhì)譜溶劑延遲時間為220s,電子轟擊電離源的電壓為70eV,檢測器電壓為1700V,傳輸線的溫度為300℃,離子源溫度為240℃,采集質(zhì)量數(shù)范圍為40~500u,采集頻率為100Spectrum/s,由Pegasus4D工作站進行控制。2結(jié)果與討論2.1萃取條件對萃取效果的影響2.1.1單一萃取頭的檢測圖1為75μmCAR/PDMS、65μmPDMS/DVB、50/30μmDVB/CAR/PDMS三種不同萃取頭在40℃萃取30min的GC×GC/TOFMS二維總離子輪廓圖,可以看出50/30μmDVB/CAR/PDMS峰的數(shù)量和響應(yīng)值都優(yōu)于其它兩種固相微萃取纖維頭。其中75μmCAR/PDMS纖維頭的斑點數(shù)量最少,一維保留時間25min后基本看不到斑點,雖然前10min的斑點亮度較高,但明顯分離效果較差,不適合糟帶魚的揮發(fā)性風(fēng)味成分的萃取;而65μmPDMS/DVB纖維頭雖然分離效果較好,一維保留時間在37min后的斑點亮度甚至比50/30μmDVB/CAR/PDMS纖維頭的響應(yīng)值稍高,但整體來說斑點的數(shù)目遠少于50/30μmDVB/CAR/PDMS纖維頭,且亮度也比50/30μmDVB/CAR/PDMS略低。比較分析不同萃取頭的峰表數(shù)據(jù),結(jié)果顯示:用50/30μmCAR/PDMS/DVB萃取頭進行萃取,相似度在800以上的色譜峰最多,總峰面積少于75μmCAR/PDMS,可能是因為中等極性材料羧乙基對糟帶魚揮發(fā)性風(fēng)味成分極易吸附和解析,但吸附的化合物種類較少,非極性材料聚二甲基硅氧烷雖然吸附量最少,但化合物的解析分離效果較好,而用三種不同極性材料復(fù)合而成的CAR/PDMS/DVB萃取頭對極性揮發(fā)性成分也有較好的吸附效果,能更好的體現(xiàn)糟魚風(fēng)味輪廓,在吸附量和分離效果方面也優(yōu)于另外兩種萃取頭。因此,本試驗選擇50/30μmCAR/PDMS/DVB萃取頭萃取分析糟帶魚中的揮發(fā)性風(fēng)味化合物。2.1.2萃取溫度的影響如圖2中A、B所示,在萃取時間等其它條件相同的情況下,50/30μmCAR/PDMS/DVB固相微萃取纖維頭在50℃萃取比30℃萃取出的色譜峰更多,且響應(yīng)值更高。使用MicrosoftExcel對不同萃取溫度(30℃、40℃、50℃、60℃)的萃取結(jié)果的峰表數(shù)據(jù)進行比較分析,結(jié)果顯示萃取溫度對萃取效果有明顯影響,即當(dāng)萃取溫度低于50℃時,萃取的化合物種類隨溫度升高而明顯增加;當(dāng)萃取溫度高于50℃時,萃取效果隨溫度升高沒有明顯變化,甚至化合物種類還有稍微減少,可能是因為高溫加速揮發(fā)性化合物的動態(tài)擴散,同時高溫使樣品基質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng),破壞一些小分子風(fēng)味化合物。試驗最終確定水浴萃取溫度為50℃。2.1.3萃取時間的影響如圖3中A、B所示,在萃取溫度及其它條件相同的情況下,萃取50min明顯比萃取10min的色譜峰更多,響應(yīng)值也更高,說明萃取時間也是影響萃取效率的重要因素。對不同萃取時間(10、20、30、40、50min)的萃取結(jié)果的峰表數(shù)據(jù)進行比較分析,結(jié)果顯示萃取時間延長有利于揮發(fā)性化合物的吸附和萃取,萃取時間在不足40min時,萃取效率隨時間延長都有明顯提高,超過40min后,萃取效果沒有明顯改變,說明萃取頭與瓶內(nèi)空間的氣體成分已經(jīng)趨于動態(tài)平衡,試驗最終確定萃取時間為40min。2.1.4色譜峰的數(shù)目有研究報道,萃取時添加飽和NaCl溶液可以有效終止魚肉酶活性,降低揮發(fā)性風(fēng)味成分的溶解度,促進揮發(fā)性化合物的揮發(fā),從而提高萃取效率。本試驗通過比較添加不同NaCl添加量的萃取效果峰表數(shù)據(jù),結(jié)果顯示添加NaCl后,揮發(fā)性化合物的總峰面積明顯增加,但色譜峰數(shù)目的變化沒有明顯規(guī)律,通過比較不同濃度NaCl的分析結(jié)果,結(jié)合文獻數(shù)據(jù),最終確定20%的NaCl。另外,試驗結(jié)果表明磁力攪拌也能在一定程度上提高萃取效率,使用磁力攪拌比與不使用磁力攪拌的萃取結(jié)果有明顯差異,色譜峰的數(shù)目略有增加,響應(yīng)值明顯增強。因此,本試驗最終采用50/30μmCAR/PDMS/DVB萃取頭在50℃水浴溫度下萃取40min,并添加質(zhì)量分數(shù)為20%的NaCl,同時使用7×15mmB型聚四氟乙烯磁力攪拌子以300r/min的速度進行攪拌,對糟帶魚的揮發(fā)性風(fēng)味化合物進行萃取。2.2揮發(fā)性風(fēng)味化合物類別分布上述確定的試驗條件下分析糟帶魚的揮發(fā)性成分,不僅分離出的化合物較多,且在兩根色譜柱上的分離效果都比較理想,如圖4。使用Pegasus4D工作站軟件進行NIST譜庫檢索,共鑒定出295種揮發(fā)性成分,其中醛類58種,占33.62%(相對峰面積,下同);酮類58種,占15.52%;酯類65種,占24.12%;醇類53種,占17.49%;酸類12種,占0.84%;呋喃類17種,占4.42%,其它33種,占3.99%,如圖5。這些揮發(fā)性風(fēng)味化合物中醛,酯、酮、醇相對含量最高,主要來源于脂肪代謝和降解、美拉德反應(yīng)以及微生物代謝作用,和呋喃等化合物一起,形成糟帶魚的風(fēng)味輪廓。采用50/30μmCAR/PDMS/DVB萃取頭結(jié)合氣相色譜高分辨飛行時間質(zhì)譜在同樣的萃取條件下對糟帶魚的揮發(fā)性風(fēng)味成分進行定性分析,只鑒定出92種揮發(fā)性風(fēng)味化合物,有文獻利用SPME-GC-MS技術(shù)在鮮帶魚、咸帶魚和風(fēng)干帶魚中分別鑒定出49、72和75中揮發(fā)性風(fēng)味成分,遠少于SPME-GC×GC-TOFMS的分析結(jié)果,這說明GC×GC-TOFMS具有較大的峰容量、更高的靈敏度和分辨率,更適合作為食品風(fēng)味成分的分析手段。2.2.1香、脂香類及支鏈醛類試驗鑒定出醛類揮發(fā)性風(fēng)味化合物共58種,相對峰面積占總揮發(fā)性成分峰面積的33.62%。3~4個碳原子的醛類物質(zhì)具有強烈的刺激性風(fēng)味,5~9個碳原子的醛類物質(zhì)具有油香、脂香風(fēng)味,分子量較高的醛具有橘子皮似的風(fēng)味,支鏈醛則具有愉快的甜味或水果特征風(fēng)味,這類化合物不僅相對含量最高,而且氣味閾值較低,可能是對糟帶魚的風(fēng)味貢獻最大的一類化合物。如正己醛、2-甲基-2-丁烯醛、(E)-壬烯醛、2-己烯醛和2-十一醛等呈現(xiàn)青香氣味的,這些風(fēng)味化合物的相對峰面積占醛類化合物總峰面積的19.72%,十六醛、十二醛、壬醛等呈花香氣味,這些風(fēng)味化合物峰面積占醛類風(fēng)味化合物總峰面積的13.3%;另外一些不飽和醛如(E)-2-辛烯醛和2,4-癸二烯醛的肉香氣味對糟帶魚的風(fēng)味也有重要貢獻。2.2.2酮類的生成試驗共鑒定出58種揮發(fā)性酮類風(fēng)味化合物,占糟帶魚總揮發(fā)性化合物峰面積的17.49%。熱降解、脂肪氧化、氨基酸降解和美拉德反應(yīng)都可以生成酮類。酮類大多呈現(xiàn)花香及果香氣息,如相對含量較高的幾種化合物中的苯乙酮、3-辛酮、3-壬酮、2-十一酮-2-壬酮、2-庚酮等都呈現(xiàn)果香和青香,有研究發(fā)現(xiàn)隨著碳鏈的增長,直鏈酮類的花香特征會逐漸增加。而檢測出的一些烯酮類化合物也是構(gòu)成糟帶魚特征風(fēng)味的重要組分,比如2-辛烯-4-酮的菠蘿香味、1-辛烯-3-酮的蘑菇香味以及3-己烯-2-酮的酒香氣味。2.2.3基層酯類化合物結(jié)構(gòu)試驗共鑒定出65種揮發(fā)性酯類風(fēng)味化合物,占糟帶魚總揮發(fā)性風(fēng)味成分的24.12%。一般而言,酯類形成主要與微生物發(fā)酵和脂肪酸代謝相關(guān),低級酯類大多呈現(xiàn)香甜的果香或花香,相對峰面積占酯類總峰面積1.0%以上的化合物有15種,其中乙酸異戊酯、己酸乙酯、戊酸乙酯、(Z)-3-己烯酸乙酯、丙酸烯丙酯、γ-丁內(nèi)酯、2-甲基丙酸乙酯和丁酸乙酯都呈現(xiàn)清甜的水果香味;在酯類化合物中相對含量最高的辛酸乙酯呈酒香氣味,還有癸酸乙酯等直鏈酯類也呈現(xiàn)酒香氣味。這些揮發(fā)性酯類化合物共同構(gòu)成了糟帶魚特有的酯香味。2.2.4酯化產(chǎn)物的揮發(fā)性試驗共鑒定出53種揮發(fā)性醇類風(fēng)味化合物。醇類可形成于脂肪酸的降解,大多呈水果和花香氣,如相對含量較高的化合物中有3-甲基-丁醇和正己醇等都呈現(xiàn)水果香氣,而苯乙醇和正壬醇呈現(xiàn)酒香氣味,松油醇呈現(xiàn)丁香花氣味;2-壬烯-1-醇和1-辛烯-3-醇被認為與新鮮魚類的揮發(fā)性特征風(fēng)味有關(guān),1-辛烯-3醇是一種亞油酸的氫過氧化物的降解產(chǎn)物,具有類似蘑菇的氣味;另外正辛醇和正戊醇等一些飽和醇的氣味閾值較高,可能對風(fēng)味貢獻不大。2.2.5呋喃類化合物呋喃類化合物是重要的含氧雜環(huán)化合物,是美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物,大都呈現(xiàn)強烈的甜香、果香和焦香氣味,如2-乙基呋喃、5-甲基-2-乙酰基呋喃、3-乙?；?2,5-二甲基