免疫細(xì)胞及其功能檢驗(yàn)技術(shù)（免疫學(xué)檢驗(yàn)課件）

免疫細(xì)胞的分離與純化免疫細(xì)胞是指參與免疫應(yīng)答或與免疫應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞，主要包括淋巴細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等。通過分離、純化免疫細(xì)胞及其亞群，并對其數(shù)量和功能測定，可以判斷機(jī)體免疫功能狀態(tài)，對指導(dǎo)臨床實(shí)踐和科學(xué)研究具有重要意義。前言免疫細(xì)胞的分離與純化免疫細(xì)胞的分離方法很多，主要根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)志、理化性狀和細(xì)胞功能等特征。應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、所分離的目的細(xì)胞群種類、數(shù)量和純度等要求選擇分離方法。所用的方法應(yīng)力求操作簡便、盡量保持細(xì)胞活性兼顧細(xì)胞純度和獲得率。一、白細(xì)胞的分離（一）自然沉降法加抗凝血于試管中室溫或37℃中靜置（30-60min）分層結(jié)果示意圖（二）高分子聚合物沉降法抗凝血與等量3%明膠或6%右旋糖酐溶液混勻室溫或37℃中靜置（30～60min）分層結(jié)果與自然沉降法類似優(yōu)點(diǎn)：速度快、得率高不足：白細(xì)胞黏性增加二、外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheralbloodmononuclearcell,PBMC）主要是指淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。PBMC是免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中最常用的細(xì)胞群PBMC也是T、B細(xì)胞分離純化的細(xì)胞來源。細(xì)胞種類密度紅細(xì)胞1.093白細(xì)胞1.092淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞1.075~1.090血小板1.030~1.035人外周血中各類血細(xì)胞密度常用的分離液：Ficoll液和Percoll液尤以密度為1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺分層液（Ficoll液）最常用。（一）

Ficoll分離法注意：溫度以20℃最適宜，超過25℃影響細(xì)胞得率（二）

Percoll分層液法連續(xù)密度梯度分離液（Percoll液+PBS，離心）加入PBMC懸液或抗凝全血1000×g離心20min結(jié)果示意圖三、淋巴細(xì)胞的純化及亞群的分離采用Ficoll和Percoll分離法獲得的細(xì)胞懸液成分仍然較為復(fù)雜、均一性不佳。通常需要進(jìn)一步分離純化淋巴細(xì)胞及其亞群。分離原理主要基于細(xì)胞的表面標(biāo)志和功能等性質(zhì)。淋巴細(xì)胞及其亞類的分離純化是免疫學(xué)檢驗(yàn)與研究的重要基礎(chǔ)技術(shù)。（一）淋巴細(xì)胞的純化去除紅細(xì)胞：低滲裂解法、氯化銨裂解法。去除血小板：多次洗滌離心法、胎牛血清梯度離心法。去除單核細(xì)胞：黏附法、羧基鐵吞噬法、苯丙氨酸甲酯去除法（二）淋巴細(xì)胞亞群的分離E花環(huán)沉降法該法簡便易行，主要用于T細(xì)胞的分離PBMC懸液與SRBC混合Ficoll法密度梯度離心收集管底細(xì)胞并低滲裂解尼龍棉分離法該法簡單快速，可分離T細(xì)胞和B細(xì)胞PBMC懸液加入尼龍棉柱37℃中靜置1～2小時(shí)預(yù)熱的含小牛血清培養(yǎng)液洗脫獲得T細(xì)胞冷培養(yǎng)液邊沖洗邊擠壓獲得B細(xì)胞（二）淋巴細(xì)胞亞群的分離免疫磁珠分離法（二）淋巴細(xì)胞亞群的分離流式細(xì)胞術(shù)分離法該法快速、細(xì)胞純度和獲得率高，可分離各種淋巴細(xì)胞及其亞群。（二）淋巴細(xì)胞亞群的分離四、吞噬細(xì)胞的分離吞噬細(xì)胞包括兩類：一類是大吞噬細(xì)胞即單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)（包括血液中的單核細(xì)胞以及組織器官中的巨噬細(xì)胞）；另一類是小吞噬細(xì)胞，即中性粒細(xì)胞。分離原理：主要根據(jù)其表面標(biāo)志和生物學(xué)特性。（一）單核細(xì)胞的分離Percoll密度梯度分離法流式細(xì)胞術(shù)分離法（常用方法）免疫磁珠分離法：分選CD14+細(xì)胞（常用方法）黏附法黏附法會影響單核細(xì)胞的功能，僅適用于去除單核細(xì)胞。（二）巨噬細(xì)胞的分離斑蝥敷貼法：（用于分離人巨噬細(xì)胞）操作要點(diǎn)：10%斑蝥酒精浸液浸泡后的濾紙?zhí)笤谇氨蹆?nèi)側(cè)皮膚，4~5小時(shí)后見皮膚局部充血，48小時(shí)后出現(xiàn)水泡，吸取滲出液（主要為巨噬細(xì)胞）、離心洗滌。腹腔滲出液分離法：（用于分離動(dòng)物巨噬細(xì)胞）操作要點(diǎn)：少量液體石蠟注入動(dòng)物腹腔內(nèi)，3~4天后沖洗出腹腔滲出液（70%~80%為巨噬細(xì)胞）。（三）中性粒細(xì)胞的分離右旋糖酐沉降法：操作要點(diǎn)：抗凝靜脈血與6%右旋糖酐溶液按比例混合，室溫條件垂直靜置一定時(shí)間后，紅細(xì)胞在右旋糖酐作用下凝集成串而快速沉降，白細(xì)胞沉降速度慢位于上層，獲取上層細(xì)胞。吞噬細(xì)胞功能檢測一、中性粒細(xì)胞功能檢測趨化功能檢測：體內(nèi)法（也稱皮膚窗口法）體外法（濾膜滲透法/

Boyden小室法、瓊脂糖平板法）吞噬功能檢測：（吞噬金黃色葡萄球菌或白色念珠菌）殺傷功能檢測：

溶菌法、硝基藍(lán)四氮唑（NBT）還原試驗(yàn)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)法--皮膚窗口法在受檢者前臂屈側(cè)中央3㎜范圍內(nèi)，搔刮皮膚后，用蓋玻片壓緊固定，在第2，5，8，12，24，36小時(shí)各取樣一次，染色觀察中性粒細(xì)胞聚集開始時(shí)間、聚集程度等。健康正常人一般2～3小時(shí)后開始聚集，達(dá)50～100個(gè)，6小時(shí)可達(dá)1000個(gè)以上。（一）中性粒細(xì)胞趨化功能檢測體外法--Boyden小室法Boyden小室體外法--瓊脂糖平板法原理及技術(shù)要點(diǎn)

在瓊脂糖凝膠平板的中孔加白細(xì)胞懸液，左孔加趨化因子，右孔加對照液，溫育4～8小時(shí)后，用顯微鏡測微器測定中性粒細(xì)胞向左孔的移動(dòng)距離A和向右孔的移動(dòng)距離B，計(jì)算趨化指數(shù)。趨化指數(shù)越大運(yùn)動(dòng)能力越強(qiáng)將細(xì)胞懸液與金黃色葡萄球菌或白色念珠菌懸液混合，溫育后涂片、固定和染色。在油鏡下觀察中性粒細(xì)胞對細(xì)菌的吞噬情況，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中吞噬和未吞噬細(xì)菌的中性粒細(xì)胞數(shù)，并記錄吞噬的細(xì)菌數(shù)。（二）中性粒細(xì)胞吞噬功能檢測（三）中性粒細(xì)胞殺傷功能檢測硝基藍(lán)四氮唑（NBT）還原試驗(yàn)

方法：1.抗凝血+硝基藍(lán)四氮唑（NBT），溫育25min；2.推片染色、鏡檢（含甲臜顆粒的中性粒細(xì)胞）。正常值：NBT陽性細(xì)胞率應(yīng)7%~15%二、巨噬細(xì)胞功能檢測炭粒廓清試驗(yàn)：主要用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)吞噬功能檢測：（吞噬雞紅細(xì)胞或白假絲酵母等）促凝血活性測定：正常小鼠肝中庫普弗細(xì)胞可吞噬清除90％炭粒，脾巨噬細(xì)胞約吞噬清除10％炭粒。據(jù)此給小鼠靜脈注射定量印度墨汁（炭粒懸液），間隔一定時(shí)間反復(fù)取靜脈血，測定血中炭粒的濃度，根據(jù)血流中炭粒被廓清的速度，判斷巨噬細(xì)胞的功能。主要用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)（一）炭粒廓清試驗(yàn)（二）巨噬細(xì)胞吞噬功能檢測巨噬細(xì)胞雞紅細(xì)胞或白假絲酵母＋孵育涂片染色鏡檢計(jì)算吞噬率和吞噬指數(shù)小結(jié)Ficoll單次密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞；流式