微生物分類鑒定方法

第四節(jié)微生物分類鑒定的方法生物分類的傳統(tǒng)指標(biāo)分子生物學(xué)指標(biāo)微型、簡便、快速或自動化鑒定技術(shù)細(xì)菌的數(shù)值分類

形態(tài)學(xué)特征生理學(xué)特征生態(tài)學(xué)特征從不同層次，用不同學(xué)科的技術(shù)方法來研究和比較不同微生物的細(xì)胞、細(xì)胞組分或代謝產(chǎn)物，從中發(fā)現(xiàn)的反映微生物類群特征的資料。生物分類的傳統(tǒng)指標(biāo)一、形態(tài)學(xué)特征培養(yǎng)特征、運(yùn)動性、特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)及其染色特性、等等微生物分類和鑒定的重要依據(jù)之一：a）易于觀察和比較，尤其是真核微生物和具有特殊形態(tài)結(jié)構(gòu)的細(xì)菌；b）許多形態(tài)學(xué)特征依賴于多基因的表達(dá)，具有相對的穩(wěn)定性；二、生理生化特征

與微生物的酶和調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的本質(zhì)和活性直接相關(guān)；代謝產(chǎn)物等營養(yǎng)類型；與氧的關(guān)系；對溫度的適應(yīng)性；對pH的適應(yīng)性；對滲透壓的適應(yīng)性；酶及蛋白質(zhì)都是基因產(chǎn)物；對微生物生理生化特征的比較也是對微生物基因組的間接比較；測定生理生化特征比直接分析基因組要容易得多；二、生理生化特征

在以實(shí)用為主要目的表型分類中，生理生化特征往往是細(xì)菌分類鑒定的主要特征。腸道菌科細(xì)菌屬和種的分類鑒定就是如此。形態(tài)和生理生化特征是最常用的細(xì)菌分類、鑒定指標(biāo)分子生物學(xué)指標(biāo)

DNA堿基因組成是各種生物一個穩(wěn)定的特征，即使個別基因突變，堿基組成也不會發(fā)生明顯變化。1.DNA的堿基組成(G+Cmol%)

分類學(xué)上，用G+C占全部堿基的克分子百分?jǐn)?shù)(G+Cmol%)來表示各類生物的DNA堿基因組成特征。每個生物種都有特定的GC%范圍，因此可以作為分類鑒定的指標(biāo)。細(xì)菌的GC%范圍為25--75%，變化范圍最大，因此更適合于細(xì)菌的分類鑒定。

GC%測定主要用于對表型特征難區(qū)分的細(xì)菌作出鑒定，并可檢驗(yàn)表型特征分類的合理性，從分子水平上判斷物種的親緣關(guān)系。G+C含量的比較主要用于分類鑒定中的否定但具有相似G+C含量的生物并不一定表明它們之間具有近的親緣關(guān)系。同一個種內(nèi)的不同菌株G+C含量差別應(yīng)在4～5%以下；同屬不同種的差別應(yīng)低于10～15%；

G+C含量已經(jīng)作為建立新的微生物分類單元的一項(xiàng)基本特征，它對于種、屬甚至科的分類鑒定有重要意義。

若二個在形態(tài)及生理生化特性方面及其相似的菌株，如果其G+C含量的差別大于5%，則肯定不是同一個種，大于15%則肯定不是同一個屬。2.核酸的分子雜交不同生物DNA堿基排列順序的異同直接反映生物之間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，堿基排列順序差異越小，它們之間的親緣關(guān)系就越近，反之亦然。直接分析比較DNA的堿基排列順序------由于技術(shù)上的困難目前尚難以普遍地進(jìn)行；核酸分子雜交(hybridization)間接比較不同微生物DNA堿基排列順序的相似性1）DNA-DNA雜交；（親緣關(guān)系相對近的微生物之間的親緣關(guān)系比較）2）DNA-rRNA雜交；（親緣關(guān)系相對遠(yuǎn)的微生物之間的親緣關(guān)系比較）3）核酸探針；（利用特異性的探針，用于細(xì)菌等的快速鑒定）4）電子雜交

隨著微生物基因信息，特別是全基因組完全測序的不斷增加，我們可以通過各種計(jì)算機(jī)軟件對不同物種的遺傳信息進(jìn)行直接比較，從而分析不同微生物間的親緣關(guān)系。3、其它血清學(xué)試驗(yàn)噬菌體分型生態(tài)特性氨基酸順序蛋白質(zhì)分析細(xì)胞壁等細(xì)胞成分通過原核生物的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合來判斷原核生物的親緣關(guān)系等等。1、API細(xì)菌數(shù)值鑒定系統(tǒng)2、Enterotube系統(tǒng)3、Biolog全自動或手動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)微型、簡便、快速或自動化鑒定技術(shù)1、API

細(xì)菌數(shù)值鑒定系統(tǒng)菌種基本培養(yǎng)基（液體）

菌懸液檢測、編碼、查表、鑒定適用于API鑒定細(xì)菌有700多種2、Enterotube系統(tǒng)不同培養(yǎng)基分裝不同小槽中，同步接種，培養(yǎng)后檢測、查表、鑒定。3、Biolog全自動或手動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)在96孔的細(xì)菌培養(yǎng)板上檢測微生物對不同發(fā)酵性碳源利用情況進(jìn)行的分類鑒定。自動化、快速可鑒定細(xì)菌有1140多種、酵母菌267種、目前已經(jīng)可用于絲狀真菌。每個孔中含有不同的底物菌懸液或無菌水細(xì)菌的數(shù)值分類

用數(shù)理統(tǒng)計(jì)的方法來處理細(xì)菌的各種特征，求出相似值，以其相似值的大小決定細(xì)菌在分類學(xué)中的關(guān)系，并把它們分為各個類群。數(shù)值分類法(numericaltaxonomy)又稱聚類分類或安德生(Adanson)法。數(shù)值分類中有兩個重要概念

2.運(yùn)轉(zhuǎn)分類單位(operationtaxonomicunit)縮寫為OUT,指分類研究的個體，細(xì)菌分類中一般是指菌株。表觀群(phenon):表觀群指建立在表面特征相似的基礎(chǔ)上的類群，一般是數(shù)值分類得到的類群。數(shù)值分類工作的程序

1.選擇菌株和待測性狀2.性狀編碼3.相似性計(jì)算4.進(jìn)行簇群分析5.分類結(jié)果的表示選擇菌株和待測性狀擬測定的性狀：包括形態(tài)、生理生化和生態(tài)等指標(biāo)。待測菌株：包括相關(guān)已知種的模式菌株。菌株數(shù)目從幾十到幾百個，注意代表性。性狀編碼多態(tài)特征:則按相關(guān)規(guī)定將其分解為多個兩態(tài)特征，或轉(zhuǎn)換為二態(tài)特征。兩態(tài)特征:陽性結(jié)果記錄為"+"，陰性為"-"，輸入計(jì)算機(jī)時陽性是"1"，陰性用"0"，資料缺失用"N"表示。將測得的性狀狀態(tài)記錄轉(zhuǎn)變成計(jì)算機(jī)能夠識別運(yùn)算的符號。相似性計(jì)算Ssm(匹配系數(shù))

Ssm=(a+b)/(a+b+c+d)Sj=a/(a+b+c+d)

a：表示兩個OTU性狀編碼皆為“1”的個數(shù)；

b：表示一個OTU為“1”，另一個OTU為“0”的性狀個數(shù)；

c：表示一個OTU為“0”，另一個OTU為“1”的性狀個數(shù)；

d：表示兩個OTU皆為"0"的性狀個數(shù)。

根據(jù)性狀測定結(jié)果計(jì)算出相似的系數(shù)，它是各個OTUs之間相似程度的量值。進(jìn)行簇群分析簇群分析也叫聚類分析(clusteranalysis)在考察各個OTU之間的相似性后，按相似的