加味四逆散對應(yīng)激性抑郁癥大鼠海馬n-甲基-d-天冬氨酸受體通道的影響

加味四逆散對應(yīng)激性抑郁癥大鼠海馬n-甲基-d-天冬氨酸受體通道的影響

慢性延遲可以誘導(dǎo)抑郁（dep），這是一個公認(rèn)的事實(shí)。儲備反應(yīng)和糖皮質(zhì)激素的增加可能會導(dǎo)致大腦除了氨酸（n-methyl-d-a）引起的內(nèi)流，并增加細(xì)胞中的ca2。例如，結(jié)合氨基酸和轉(zhuǎn)化前環(huán)氨酸（n-med）的受體，促進(jìn)ga2及其內(nèi)流。還可以激活ca2及其相關(guān)酶或調(diào)節(jié)酶，溶解細(xì)細(xì)胞骨框架，分解一些蛋白質(zhì)，改變一些遺傳因素的出現(xiàn)，導(dǎo)致器官疾病和殘疾。因此,在以往的研究中,對谷氨酸通過受體介導(dǎo)神經(jīng)毒作用的研究主要集中在離子型谷氨酸受體上。應(yīng)激性抑郁癥發(fā)病的一個重要機(jī)制是NMDA受體介導(dǎo)的興奮性毒性對海馬神經(jīng)元的損傷,目前,NMDA受體已成為抗抑郁劑研究的一個藥理學(xué)作用靶點(diǎn)。在中醫(yī)肝主疏泄的理論指導(dǎo)下,我們對調(diào)肝方藥加味四逆散(JWSNS)防治應(yīng)激性抑郁癥進(jìn)行了一系列的研究,以往的研究結(jié)果表明,JWSNS對應(yīng)激性抑郁癥下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamus-pituitary-adrenalgland,HPA)軸具有整體調(diào)節(jié)作用,對慢性心理應(yīng)激過程中中樞多種神經(jīng)遞質(zhì)及其合成酶、神經(jīng)肽、激素、環(huán)核苷酸系統(tǒng)以及即早基因Fos蛋白表達(dá)等有明顯影響,表現(xiàn)出多層次、多靶點(diǎn)以及多環(huán)節(jié)的作用特點(diǎn);作用的腦區(qū)涉及到下丘腦(包括不同核團(tuán))、海馬、杏仁核等。在本研究中,我們以海馬NMDA受體為研究對象,進(jìn)一步闡釋JWSNS抗抑郁的作用機(jī)制及其具體的作用靶點(diǎn)。1材料和方法1.1模型分組和使用采用慢性輕度不可預(yù)計(jì)應(yīng)激(chronicmildunpredictablestress,CMUS)動物模型并加以改進(jìn):接受應(yīng)激處理的大鼠單獨(dú)放在一間獨(dú)立的房間,在21d內(nèi)接受不同應(yīng)激原的刺激。應(yīng)激原包括:限制空間1h、45°斜籠7h、濕籠17h(200g鋪料倒100ml水,使墊料濕透)、新入侵者(兩籠并籠)23h、持續(xù)光照36h、空瓶1h、禁食禁水23h。造模前:所有大鼠單籠飼養(yǎng)1wk適應(yīng)環(huán)境。d1:接受雙瓶訓(xùn)練,一瓶是1%(W/V)蔗糖水(在籠左側(cè)),一瓶是純水(在籠右側(cè)),訓(xùn)練48h(d19:30至d39:30);d3:9:30開始禁食禁水23h至d48:30;d4:8:30進(jìn)行1h糖水消耗實(shí)驗(yàn)。根據(jù)糖水消耗實(shí)驗(yàn)結(jié)果和體重情況進(jìn)行分組。造模期:每天8:30灌胃,模型組與正常組分房飼養(yǎng),單籠飼養(yǎng)。d1:9:30～10:30限制空間1h。d220:30至d38:30持續(xù)光照36h。d3:9:30～16:3045°斜籠7h。d4:9:30至d5:8:30兩籠并籠,新入侵者23h。d5:9:30開始禁水3h,12:30～13:30空瓶1h;15:30至d6:8:30濕籠17h。d6:16:00至d7:15:00開始禁食禁水23h。d8:8:30至d9:20:30持續(xù)光照36h。d10:9:30至d11:8:30兩籠并籠,新入侵者23h。d11:9:30開始禁水3h,12:30～13:30空瓶1h;15:30～16:30限制空間1h。d12:9:30～16:3045°斜籠7h;16:30至d139:30濕籠17h。d13:9:30至d14:8:30開始禁食禁水23h。d14:15:30～16:30限制空間1h。d15:9:30至d168:30兩籠并籠,新入侵者23h。d16:8:30至d17:20:30持續(xù)光照36h。d18:9:30開始禁水3h,12:30～13:30空瓶1h,15:30至d19:8:30濕籠17h。d20:9:30～16:3045°斜籠7h。16:00至d21:15:00開始禁食禁水23h。d21:15:00～16:00開始糖水消耗實(shí)驗(yàn)(包括測體重)。1.2中藥復(fù)方j(luò)wsnsSPF級Wistar大鼠,♂性,體重180～220g,廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。動物自由飲水與進(jìn)食,在光暗周期為12h,溫度為(23±2)℃的安靜環(huán)境適應(yīng)1wk后,根據(jù)糖水消耗實(shí)驗(yàn)結(jié)果和體重情況進(jìn)行分組。分4組:正常組(不施加任何刺激)、應(yīng)激性抑郁癥模型組(簡稱模型組)、JWSNS組(每天早上8:30灌胃中藥復(fù)方JWSNS,每次2ml)和MK801組(每天早上8:30腹腔注射MK8010.2mg·kg-1·d-1)。正常組及模型組每次灌胃等量蒸餾水。其中正常組大鼠與其余各組大鼠分房飼養(yǎng)。中藥復(fù)方JWSNS由柴胡、白芍、枳殼、枸杞子、干地黃等組成。藥材由本校第一附屬醫(yī)院藥房提供,經(jīng)藥劑科鑒定均為純正藥材。將中藥制成粗粉,首煎將中藥粗粉置8倍溫水中浸泡0.5h,沸騰后文火煎煮4h,注意均勻攪拌,取汁后經(jīng)3層紗布過濾;第2次和第3次煎煮均分別以6倍水文火煎煮2h,同樣方法取汁,合并3次藥液,置水浴箱內(nèi)濃縮至含生藥1.69g·ml-1。藥液常溫冷卻后,置4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?.3g-bw生藥根據(jù)我們預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,大鼠按臨床等效劑量灌胃給藥(8.45g·kg-1BW生藥),2次/d,連續(xù)3d,于末次給藥1h后,無菌條件下,腹主動脈取血,離心分離后的大鼠血清于56℃水浴中30min滅活,再經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾除菌,分裝,-20℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?.4儀器、儀器和分析軟件紅四氮哇(TTC)由上海試劑三廠提供。4%多聚甲醛、0.1mol·L-1枸櫞酸鹽緩沖液、PBS緩沖液、復(fù)合消化液、中性樹脂等均由武漢博士德公司提供。二甲基亞砜購自唯佳公司。Fura-2AM(MolecularprobesInc.USA)。MK801、NMDA、甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glu)、羥乙基磺酸鈉等均購自美國Sigma公司。儀器:低溫高速離心機(jī)(3K18,Sigma,USA),酶標(biāo)儀(Bio2TEKElx800uv),光學(xué)顯微鏡及攝像系統(tǒng)(OLYMPUS,1X71),微電極拉制儀(P-97,USA),電極拋光儀(BV-10,USA),振動切片機(jī)(M752,USA),正置顯微鏡(ZEISS,German),三維操縱系統(tǒng)(MP-285,USA),膜片鉗放大系統(tǒng)(EPC-9,German),數(shù)據(jù)采集和信號分析軟件:Pusle、Puslefit,膜片鉗信號分析處理軟件:TAC、TACfit。CCD攝像頭,LPS-150激發(fā)光源,Tillvision圖像處理系統(tǒng)。1.5觀察項(xiàng)目和測試方法1.5.1底糖消耗試驗(yàn)所有大鼠在完成1wk的單籠飼養(yǎng)適應(yīng)后,接受雙瓶訓(xùn)練,一瓶是1%(W/V)蔗糖水(在籠左側(cè)),一瓶是純水(在籠右側(cè)),訓(xùn)練48h。然后所有大鼠禁食禁水23h后,進(jìn)行1h糖水消耗試驗(yàn),測量基礎(chǔ)糖水消耗量及基礎(chǔ)體重。經(jīng)過禁食禁水23h后,在整個應(yīng)激進(jìn)程的d21:15:00～16:00進(jìn)行糖水消耗實(shí)驗(yàn),并測量體重。1.5.2活性化合物的檢測海馬腦片的制備:各組大鼠斷頭處死,迅速取腦,浸入混合氧氣(95%O2和5%CO2)飽和的預(yù)冷的高蔗糖液中,經(jīng)振動切片機(jī)制成400μm腦片,分離出海馬,并將海馬腦片移入預(yù)先進(jìn)行氧飽和的Earles′s平衡鹽溶液(g·L-1,Earles′sbalancesalinesolution,EBSS。CaCl2·2H2O0.265g、MgSO40.09767g、KCl0.4g、NaCl6.8g、Na2HPO40.122g、葡萄糖1.0g、酚紅0.011g,加dH20至1000ml,NaOH調(diào)pH值至7.35～7.4)中,室溫下恢復(fù)孵育90min。TTC染色:海馬腦片在2%TTC溶液中避光孵育30min,生理鹽水漂洗,吸去表面水分,稱濕重,以1g∶20ml的比例加入抽提液(乙醇∶二甲基亞砜=1∶1),避光24h。按100μl每孔的比例加至96孔板,酶標(biāo)儀測定490nm處各孔吸光度。組織損傷百分率=(1-OD490損傷/OD490對照)×100%。1.5.3組患者治療前后血壓指標(biāo)比較取正常大鼠制備海馬腦片,制備方法同上。實(shí)驗(yàn)分為4組,即正常組、谷氨酸損傷模型組(簡稱模型組)、JWSNS,MK801組。以上各組分別采用20%空白血清、20%空白血清+200μmol·L-1的谷氨酸、20%JWSNS含藥血清+200μmol·L-1谷氨酸、200μmol·L-1MK801+20%空白血清+200μmol·L-1的谷氨酸的混合氣體飽和的EBSS液孵育60min,再分別在EBSS液恢復(fù)正常孵育2h后進(jìn)行TTC染色。1.5.4微電極的拉制、充灌和高阻封接的形成過程海馬神經(jīng)元急性分離:大鼠迅速斷頭取腦,分離海馬,置于處理好的高蔗糖溶液中冰凍持續(xù)通混合氣1min。然后將海馬均勻的切成約400μm的腦片,放置33℃EBSS液孵育1.5h,孵育時通混合氣。用羥乙基磺酸鈉清洗組織塊,反復(fù)3次。然后用針頭將組織塊戳碎,用蛋白酶E(1.1～1.4mg溶于1mlHBSS)消化35min,再用羥乙基磺酸鈉清洗組織塊,反復(fù)3次,終止消化。用尖端經(jīng)火拋光處理的口徑依次為500、300、150μm的巴氏管吹開組織塊,制成細(xì)胞懸液。將吹打后的細(xì)胞懸液靜置5～10min,吸取上清液,滴于涂有多聚賴氨酸的蓋玻片上,靜置10min,使細(xì)胞充分貼壁。加入2～3ml浴液即可進(jìn)行單通道記錄。玻璃微電極的拉制及充灌:將外徑1.5mm、內(nèi)徑為1.17mm的硬質(zhì)玻璃毛胚(SUTTER公司)在微電極拉制器上經(jīng)2次拉制成尖端直徑1μm的微電極,以0.2μm的微孔濾膜過濾電極充灌液。充灌后的微電極電阻為3～15MΩ。高阻封接的形成:將貼附有細(xì)胞的蓋玻片放入培養(yǎng)皿中,加入2ml浴液。在倒置顯微鏡下選擇貼壁良好,細(xì)胞膜完整,核明顯,有立體感和明顯突起的細(xì)胞。電極入水前在電極腔內(nèi)加正壓,操縱推進(jìn)器使電極接近細(xì)胞。當(dāng)微電極尖端剛剛碰到細(xì)胞時,給微電極腔內(nèi)一定的負(fù)壓,稍加負(fù)壓,高阻密封即刻形成(阻抗>10GΩ)。實(shí)驗(yàn)室溫度20～25℃。單通道電流記錄和分析:記錄到的單通道電流經(jīng)EPC-9膜片鉗放大器,放大器反饋電阻為50GΩ以上,高通濾波為10Hz,低通濾波為1.0Hz,用Pulsefit+Pulse采集入計(jì)算機(jī),采樣頻率為50kHz,采樣時間為10s。用分析軟件TAC進(jìn)行測量,測量通道開放和關(guān)閉時間的分辨率為0.2ms,以-120V鉗制電壓下的電流幅度的50%(約為1.3pA)作為判斷通道開放與關(guān)閉的轉(zhuǎn)換,測量獲得的數(shù)據(jù)用TACFIT軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。1.5.5ph值的預(yù)處理海馬神經(jīng)元急性分離同上。負(fù)載熒光指示劑Fura-2/AM:用低鈣羥乙基磺酸鈉緩沖液(g·L-1,羥乙基磺酸鈉19.6g、KCl0.194g、MgCl20.813g、CaCl20.0147g、HEPES3.574g、葡萄糖4.144g,加dH20至1000ml,NaOH調(diào)pH值至7.2～7.4)清洗3次。然后用尖端經(jīng)火拋光處理的口徑依次為500、300μm和150μm的pasteur吸管進(jìn)行吹打,制成細(xì)胞懸液,并將其移入35mm培養(yǎng)皿,貼壁10min。細(xì)胞貼壁后加入二甲基亞楓溶解的Fura-2/AM,終濃度5μmol·L-1,室溫下負(fù)載45min,中間晃動2次,用無鈣的HBSS液沖洗3次,去除胞外殘余的Fura-2/AM后。將蓋玻片移至培養(yǎng)皿中,皿中為含有1.3mmol·L-1CaCl2的HBSS液。陽離子成像系統(tǒng)檢測海馬神經(jīng)元內(nèi)單個細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度:將培養(yǎng)皿移至熒光顯微鏡的載物臺,用膠布固定。在Tillvision中設(shè)置熒光激發(fā)方案,交替用340nm和380nm波長激發(fā),曝光時間為40ms,每個循環(huán)之間的時間間隔為最短。用Tillvision軟件進(jìn)行圖像分析,記錄340nm和380nm處熒光強(qiáng)度,除去自發(fā)熒光后計(jì)算出F340/F380比值,用此比值代表Ca2+濃度。1.6統(tǒng)計(jì)處理所有數(shù)據(jù)以ˉx±s表示,采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。2應(yīng)激性抑郁癥大鼠海馬腦片損傷特征2.1各組大鼠體重及糖水偏愛度的變化造模前各組大鼠體重?zé)o差別(P>0.05),經(jīng)過21dCMUS造模后,模型組、JWSNS組和MK801組體重及增重明顯低于正常組(P<0.01),而此3組組間無差異,見Tab1。表明CMUS可引起大鼠體重下降,而JWSNS及MK801對大鼠體重的下降無影響。造模前各組大鼠糖水偏愛度無差別(P>0.05),經(jīng)過21dCMUS造模后,模型組糖水偏愛度明顯低于正常組(P<0.01),表明CMUS可引起大鼠糖水偏愛度下降,而JWSNS及MK801能逆轉(zhuǎn)應(yīng)激性抑郁大鼠糖水偏愛度的下降(P<0.05,P<0.01),見Tab2。2.2各組大鼠海馬腦片TTC染色結(jié)果考慮到MK801組損傷率最低,故取MK801組海馬光密度值的均數(shù)1.4002作為OD490對照值計(jì)算各組海馬腦片損傷百分率。模型組海馬光密度值明顯低于正常組(P<0.01),海馬腦片損傷百分率明顯高于正常組(P<0.01);JWSNS組和MK801組均能明顯升高應(yīng)激性抑郁癥大鼠海馬光密度值(P<0.05,P<0.01),降低其海馬腦片損傷百分率(P<0.05,P<0.01),見Tab3。2.3JWSNS含藥血清對高濃度谷氨酸海馬腦片損傷模型TTC染色結(jié)果取正常組海馬光密度值的均數(shù)1.363作為OD490對照值計(jì)算各組海馬腦片損傷百分率。與正常組比較,200μmol·L-1的高濃度谷氨酸海馬腦片TTC染色光密度值明顯降低(P<0.01),海馬損傷百分率明顯升高(P<0.01);20%JWSNS含藥血清和MK801可明顯升高TTC染色光密度值,降低高濃度谷氨酸引起的海馬損傷(P<0.01),見Tab4。2.4大鼠海馬神經(jīng)元NMDA受體通道的特征同一鉗位電壓下,其通道電流幅度基本相同,呈時間不等的矩形波和短時程的單波,其幅度分布直方圖呈對稱單峰狀。隨著膜超極化程度加大時,單通道內(nèi)向電流隨之增大。電流與膜電位呈直線關(guān)系,其斜率即是電導(dǎo)值,見Fig1。2.5各組大鼠海馬NMDA受體通道的開放概率及平均開放時間(鉗制電壓為-120mV)的變化與正常組比較,模型組大鼠海馬NMDA受體通道開放概率明顯增高(P<0.05),而JWSNS、MK801能明顯降低應(yīng)激性抑郁癥大鼠海馬NMDA受體通道開放概率(P<0.05,P<0.01);在海馬NMDA受體通道平均開放時間方面,4組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見Fig2、Tab5。2.6各組大鼠海馬單個神經(jīng)元內(nèi)游離Ca2+濃度的變化與正常組比較,模型組大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)游離Ca2+濃度明顯升高(P<0.01),而JWSNS、MK801能明顯降低應(yīng)激性抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)游離Ca2+濃度(P<0.01),見Tab6。3糖皮質(zhì)對海馬損傷的保護(hù)作用CMUS抑郁癥模型的原理是模擬抑郁癥的環(huán)境誘因以及核心癥狀——快感缺失。由于CMUS模擬的應(yīng)激原更接近于現(xiàn)實(shí)生活,且CMUS引起的行為改變能夠持續(xù)幾周甚至數(shù)月被觀察到,因此該模型不僅可用于抗抑郁藥效學(xué)的研究,而且更適合抗抑郁劑作用機(jī)制的研究。模型的成功與否是以1%糖水偏愛度下降來判定。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),JWSNS和MK801能夠使CMUS抑郁癥大鼠的1%糖水偏愛度升高,具有抗抑郁的作用。MK801是一種非選擇性NMDA受體拮抗劑,這也說明了在慢性應(yīng)激所致的抑郁癥,NMDA受體的過度激活是其病理機(jī)制之一。但JWSNS和MK801對CMUS引起的體重下降卻沒有影響,這種現(xiàn)象與國外許多抗抑郁劑的研究報道一致。CMUS引起大鼠增重緩慢可能與應(yīng)激性抑郁癥的關(guān)系不大,因?yàn)樵谔撬珢鄱扰c體重這兩個指標(biāo)之間并不存在著關(guān)聯(lián)性。應(yīng)激引起的高皮質(zhì)酮血癥可能是導(dǎo)致抑郁癥發(fā)生的最直接的生化基礎(chǔ),這種生化水平的變化可導(dǎo)致海馬等腦區(qū)形態(tài)學(xué)的改變,最終影響其功能的發(fā)揮。應(yīng)激引起海馬神經(jīng)元損傷可能是中樞許多應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)節(jié)點(diǎn),因此保護(hù)中樞神經(jīng)元,尤其是海馬神經(jīng)元免受傷害,是防治應(yīng)激相關(guān)疾病的重要措施之一。慢性應(yīng)激性抑郁癥引起的海馬神經(jīng)元損傷并不是糖皮質(zhì)激素獨(dú)立的作用,更多地是其通過影響其它神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)生間接作用,導(dǎo)致海馬損傷。近幾年來,國際上一些學(xué)者通過研究對傳統(tǒng)精神病理的遞質(zhì)學(xué)說提出了質(zhì)疑,認(rèn)為谷氨酸及其受體在許多精神心理障礙的發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用,其他神經(jīng)遞質(zhì)如NE、5-HT、DA等是在谷氨酸異常的基礎(chǔ)上變化的。谷氨酸是一種典型的興奮性氨基酸,是引起神經(jīng)細(xì)胞毒性損害的重要因素,谷氨酸的興奮毒性作用主要是由NMDA受體所介導(dǎo)的,糖皮質(zhì)激素通過其受體引起神經(jīng)元損傷也要由NMDA受體的激活來實(shí)施。因此如何抵抗谷氨酸對海馬神經(jīng)元的損傷作用,調(diào)控NMDA受體活性是一個非常重要的因素。本實(shí)驗(yàn)通過對海馬神經(jīng)元的TTC染色,證實(shí)CMUS抑郁癥大鼠確實(shí)出現(xiàn)了明顯的海馬損傷,而JWSNS對這種海馬損傷具有一定的保護(hù)作用,但效果不如MK801;結(jié)合JWSNS含藥血清對高濃度谷氨酸引起海馬損傷的保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,可以初步認(rèn)為,JWSNS具有對抗NMDA受體介導(dǎo)的高濃度谷氨酸興奮性毒性的作用。膜片鉗技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于細(xì)胞膜離子通道電流的測量,在膜片鉗記錄模式中,細(xì)胞貼附式是一種經(jīng)典的單通道記錄模式。當(dāng)含谷氨酸(20μmol·L-1)和甘氨酸(1μmol·L-1)電極內(nèi)液的記錄電極與神經(jīng)元胞體形成高阻封接后,膜電位在-40～-140mV改變時,采用細(xì)胞貼附方式可記錄到內(nèi)向的單通道電流。電流幅度隨著超極化程度加重而增大。本實(shí)驗(yàn)觀察到多數(shù)膜片的NMDA受體通道為單一電導(dǎo)狀態(tài),電導(dǎo)分別為10pS及30pS,其中以30pS占多數(shù),而且以短開放為主,同時有長開放通道,偶爾可發(fā)現(xiàn)猝發(fā)性開放式長開放通道。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,與正常組相比,CMUS抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元單個NMDA受體的開放概率明顯升高,平均開放時間雖與正常組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但從數(shù)值上來看,也有升高的趨勢(通道平均開放時間:模型組>JWSNS組>正常組>MK801組,與開放概率的排序一致),這充分說明CMUS抑郁癥大鼠海馬神經(jīng)元單個NMDA受體的功能亢進(jìn)。細(xì)胞內(nèi)信使Ca2+介導(dǎo)許多胞內(nèi)反應(yīng),胞內(nèi)Ca2+濃度升高可以激活和調(diào)節(jié)許多細(xì)胞激酶和級聯(lián)反應(yīng),其中一個嚴(yán)重的結(jié)果是引起細(xì)胞損傷或死亡。但大量的研究表明,細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度與細(xì)胞死亡可能性并非絕對對應(yīng)關(guān)系。神經(jīng)元的死亡與細(xì)胞內(nèi)Ca2+的位置和來源有關(guān)。胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+,尤其是樹突棘內(nèi)的Ca2+濃度升高,預(yù)示著神經(jīng)細(xì)胞死亡的可能性。來自于細(xì)胞外,而不是來自細(xì)胞器;來自細(xì)胞線粒體,而不是來自于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ca2+更能引起細(xì)胞的死亡。電壓依賴性的Ca2+引起的鈣超載對神經(jīng)元細(xì)