四逆湯中附子配伍甘草解毒增效作用機制研究

四逆湯中附子配伍甘草解毒增效作用機制研究

四逆湯由附子、甘草（炒）和干姜組成。主要用于治療冠狀動脈粥樣硬化和心絞痛等緊急情況?，F(xiàn)代臨床實踐和藥理學(xué)研究表明,四逆湯對心肌缺血-再灌注損傷(MI-RI)的心肌細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用,可以影響其代謝、形態(tài)及功能等。四逆湯中君藥附子具回陽救逆之功,但燥熱峻猛毒烈,配伍甘草,以“制其偏性,解毒存性”。目前對附子配伍甘草解毒增效機制進(jìn)行了大量而有價值的研究,但從生物體對四逆湯復(fù)方多成分之整體反應(yīng)的角度闡釋該機制的研究尚薄弱。本實驗采用H9c2心肌細(xì)胞,建立體外MI-RI模型,研究四逆湯中附子配伍甘草解毒增效機制,并采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)對細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行代謝組學(xué)研究,進(jìn)而從代謝組學(xué)角度探討四逆湯中附子配伍甘草的解毒增效機制。1材料表面1.1超凈從根、中、省氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(7890AGC-5975MSD,Agilent)、CO2培養(yǎng)箱(ThermoElectronCorporation);立式高壓蒸汽高壓滅菌器(MLS-3020,SANYO);雙人雙面超凈工作臺(SW-CJ-2F);通用離心機(HeraeusMegafuge1.0R,Thermo);酶標(biāo)儀(PCplus384);透射電鏡(H-600IVHitachi);倒置顯微鏡(CK40,OLYMPUS);氮氣吹干儀(BF2000-15A);微型旋渦混合器(WH-3)。1.2酶ldhDMEM高糖培養(yǎng)基,0.25%胰蛋白酶溶液(HyClone);胎牛血清FBS(蘭州民海生物工程有限公司);DMSO(成都科龍化工試劑廠);MTT(Solarbio公司);磷酸鹽緩沖液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);鏈霉素(大連美羅制藥廠);青霉素(華北制藥廠);LDH,CK試劑盒(南京建成生物工程研究所);乳酸、甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、葡萄糖、果糖、甘露糖、3-磷酸甘油、谷氨酰胺、棕櫚酸、硬脂酸(上海安研商貿(mào)有限公司);乙腈、甲醇(FisherChemicals公司);甲氧胺鹽酸鹽、MSTFA、正庚烷、TMCS、吡啶(Sigma-Aldrich公司),實驗用水均為超純水(Milli-Q級),其余試劑均為分析純。2方法和結(jié)果2.1火提取液的制備四逆湯樣品:取生附片30g、炙甘草30g和干姜20g,置于圓底燒瓶中,加8倍量水浸泡0.5h,回流提取,武火煮沸后文火保持微沸1.5h,提取液趁熱用紗布濾過;提取3次,合并水提液,減壓濃縮至適量,加去離子水定容至100mL。缺甘草四逆湯樣品:取生附片48g和干姜32g,其他操作同上,即得缺甘草四逆湯樣品溶液100mL。2.2硫酸鈉“缺氧”溶液的配置取化學(xué)缺氧劑Na2S2O3溶于PBS中,按試驗中要求配制成各濃度“缺血”液,混勻,經(jīng)0.22μm濾器濾過,避光,臨用現(xiàn)配。2.3逆湯單次用藥SD大鼠,清潔級,體重(200±20)g,雌雄各半,實驗動物生產(chǎn)許可證編號SCXK(川)2008-24,試驗前12h禁食不禁水。隨機分為3組(正常組、四逆湯組、缺甘草四逆湯組),每組8只。四逆湯組:灌胃四逆湯(預(yù)先溫?zé)?,給藥量為20μL·g-1體重,每天1次,連續(xù)7d。缺甘草四逆湯:灌胃缺甘草四逆湯(預(yù)先溫?zé)?,其他同四逆湯組。正常組:于第7天灌胃等量的生理鹽水。末次給藥后0.5h,眼眶后靜脈叢取血,靜置1h,離心(4500r·min-1,10min),分離血清,-70℃冷凍保存。取含藥血清和空白血清,室溫解凍,56℃水浴滅活30min,用DMEM配制細(xì)胞培養(yǎng)液(含血清10%),經(jīng)0.22μm濾器濾過,除菌,臨用現(xiàn)配。2.4生長分組和傳代H9c2大鼠心肌細(xì)胞株(ATCC,CRL-1446,武漢博士德生物技術(shù)公司)于含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基(含青霉素100U·mL-1、鏈霉素100U·mL-1)中培養(yǎng)(培養(yǎng)箱條件為37℃,5%CO2)。貼壁生長后,2~3d傳代1次,按1∶4傳代。狀態(tài)良好的取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行試驗。2.5實驗分組及結(jié)果調(diào)大鼠心肌細(xì)胞H9c2密度為8×104個/mL,接種于96孔培養(yǎng)板,每孔接種200μL;調(diào)細(xì)胞密度為5×104個/mL,接種于6孔培養(yǎng)板,每孔接種2mL。培養(yǎng)2~3d,待細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%~90%時進(jìn)行試驗。心肌細(xì)胞MI-RI模型的制備:更換正常細(xì)胞培養(yǎng)液為等量的“缺血液”,置CO2培養(yǎng)箱中孵育2h,造成細(xì)胞缺血。再將“缺血液”換為正常細(xì)胞培養(yǎng)液,孵育24h,對細(xì)胞造成再灌注損傷?？疾焖哪鏈叭备什菟哪鏈珜π募〖?xì)胞MI-RI造模后損傷的作用及細(xì)胞培養(yǎng)液的分析,取心肌細(xì)胞隨機分為4組,每組6復(fù)孔。試驗分組如下:正常對照組,常規(guī)培養(yǎng),細(xì)胞培養(yǎng)過程中不予任何干預(yù);MI-RI模型組,造模后,加含10%空白血清的培養(yǎng)基;四逆湯組,造模后,加含10%四逆湯組大鼠血清的培養(yǎng)基;缺甘草四逆湯組,造模后,加含10%缺甘草四逆湯組大鼠血清的培養(yǎng)基。MTT法檢測各組細(xì)胞存活率及生化指標(biāo),結(jié)果見表1。收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液于-20℃密封保存待測。2.6四逆湯甘草不多對mi-ri細(xì)胞的影響2.6.1mi-ri模型各組對心肌細(xì)胞的損傷程度心肌細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中分別經(jīng)過上述各組所述方法處理后,于倒置顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞的形態(tài)和生活狀況,并拍攝顯微照片。實驗結(jié)果顯示,加不同濃度Na2S2O3的PBS溶液作用后,與正常對照組的心肌細(xì)胞相比,模型組心肌細(xì)胞體積均有變小,且隨著濃度的增加,形態(tài)損傷也隨之加重,并出現(xiàn)細(xì)胞脫落現(xiàn)象;作用時間越長細(xì)胞損傷程度越明顯;1.5mmol·L-1組,作用2h的心肌細(xì)胞損傷更加嚴(yán)重?？瞻讓φ战M:心肌細(xì)胞生長旺盛,細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰。MI-RI模型組:心肌細(xì)胞開始變得粗糙,形態(tài)顯不規(guī)則,細(xì)胞間隙增大,開始有細(xì)胞脫落的現(xiàn)象出現(xiàn)。四逆湯組:細(xì)胞可明顯抑制再灌注對心肌細(xì)胞的損傷,表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)雖稍有變小但仍很規(guī)則,間隙仍保持緊密,懸浮細(xì)胞明顯減少。缺甘草四逆湯組:與四逆湯組相似,但部分細(xì)胞仍有損傷,見圖1。2.6.2mtt細(xì)胞存活率測定采用MTT比色法檢測(邊緣孔用空白培養(yǎng)基填充為空白對照組)。接種于96孔培養(yǎng)板中的各組心肌細(xì)胞,進(jìn)行相應(yīng)處理后,每孔加MTT溶液(5g·L-1)20μL,于孵箱中孵育4h,小心移棄培養(yǎng)液,每孔加150μLDMSO,振蕩10min,混合均勻,用酶標(biāo)儀測定各孔吸光度A(檢測波長為490nm),計算細(xì)胞存活率,見表1。細(xì)胞存活率=試驗組平均吸光度A/對照組平均吸光度A×100%。2.6.3不同給藥劑量對大鼠心肌細(xì)胞存活率和時間活性的影響分別各組心肌細(xì)胞上清培養(yǎng)液,分別按照LDH和CK試劑盒說明書進(jìn)行檢測。采用MATLAB(R2009a,TheMathWorks,Inc.)統(tǒng)計函數(shù)對實驗結(jié)果進(jìn)行處理,采用t檢驗判定各組與正常對照組數(shù)據(jù)間差異,見表1。結(jié)果顯示,與正常H9c2心肌細(xì)胞比較,模型組和缺甘草四逆湯組的心肌細(xì)胞存活率顯著下降(P<0.01),LDH及CK活性顯著升高(P<0.01);四逆湯組心肌細(xì)胞存活率和CK活性明顯升高(P<0.05),LDH活性顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,四逆湯組的存活率顯著升高(P<0.01),缺甘草四逆湯組存活率明顯升高(P<0.05);四逆湯組和缺甘草四逆湯組的LDH活性、CK活性均顯著降低(P<0.01)。缺甘草四逆湯組與四逆湯組相比,心肌細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.01),2組的LDH活性相接近,CK活性有明顯差異(P<0.05)。說明四逆湯組及缺甘草四逆湯組可有效保護(hù)MI-RI模型對H9c2心肌細(xì)胞的損傷,且四逆湯組保護(hù)作用更加顯著。2.7四逆湯甘草不足對mi-ri心肌細(xì)胞代謝的研究2.7.1衍生化試劑制備取細(xì)胞培養(yǎng)液樣品于室溫解凍,精密吸取100μL,加甲醇800μL,渦旋混合1min;離心15min(轉(zhuǎn)速1.2×104r·min-1),取上層萃取液300μL于氮氣吹干設(shè)備中低溫(30℃)吹干,殘渣加75μL甲氧胺吡啶溶液(甲氧胺濃度15g·L-1),渦旋混合2min,于70℃烘箱中肟化1h;加75μL衍生化試劑MSTFA(含1%TMCS)渦旋混合2min,室溫靜置1h;加1mL正庚烷(含內(nèi)標(biāo)白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ0.0328g·L-1),渦旋混合30s;離心10min(轉(zhuǎn)速4.0×103r·min-1),取上清300μL至GC進(jìn)樣瓶,即得。2.7.2標(biāo)準(zhǔn)條件及掃描方式HP-5MS毛細(xì)管柱(250mm×30m,0.25μm,Angilent),載氣為高純氦氣,流速1mL·min-1;進(jìn)樣量1.0μL,不分流進(jìn)樣;進(jìn)樣口260℃;離子源(EI)230℃;四極桿150℃;電離電壓70eV;He掃氣流量10mL·min-1;掃描方式:全掃描模式,m/z30~600。升溫程序(初始溫度70℃,保持4min;以每分鐘6℃升溫至115℃;再以每分鐘4℃升溫至126℃;以每分鐘6℃升溫至190℃;以每分鐘1℃升溫至194℃,保持2min;最后以每分鐘3℃升溫至280℃)。2.7.3潛在代謝標(biāo)志物的篩選、鑒定和分析方法實驗所得GC-MS圖譜數(shù)據(jù)通過XCMS-online(/download/)工具箱進(jìn)行峰校正、峰對齊和峰積分等預(yù)處理后,采用Matlab軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理,為避免誤差,采用內(nèi)標(biāo)(白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ)作為參比。數(shù)據(jù)預(yù)處理后的3個數(shù)據(jù)集(空白對照組A+模型組B、模型組B+四逆湯組C、模型組B+缺甘草四逆湯組D)分別導(dǎo)入多維分析軟件(SIMCA-P13.0,Sweden)中,進(jìn)行主成分分析(PCA)、偏最小二乘判別分析(PLS-DA)及正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA),經(jīng)模式識別與特征代謝物的提取,得到引起2組間差異的主要潛在代謝標(biāo)志物所對應(yīng)的保留時間和m/z,經(jīng)NIST08質(zhì)譜庫檢索、AMDIS鑒定、文獻(xiàn)對照和標(biāo)準(zhǔn)品比對等方法,對潛在生物標(biāo)志進(jìn)行指認(rèn)。對17個潛在代謝標(biāo)志物的相對含量,采用MinitabV15.0(StateCollege,USA)軟件進(jìn)行One-WayANO-VA(置信區(qū)間95%)檢驗,見表2,圖2。17個潛在代謝標(biāo)志物中,四逆湯組與缺甘草四逆湯組的潛在代謝標(biāo)志物有明顯的區(qū)別,僅四逆湯組回調(diào)的潛在代謝標(biāo)志物:尿素、甘氨酸、硬脂酸和未知成分2;僅缺甘草四逆湯組回調(diào)的潛在代謝標(biāo)志物:亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸和脯氨酸;二者共同回調(diào)的潛在代謝標(biāo)志物:乳酸、未知成分1、纈氨酸、3-磷酸甘油、谷氨酰胺、果糖、葡萄糖、甘露糖和棕櫚酸。3逆湯對甘草解的調(diào)節(jié)本研究采用體外心肌細(xì)胞試驗,通過測定LDH與CK活性,二者是評價心肌缺血程度的客觀指標(biāo),也是判斷MI-RI心肌細(xì)胞不可逆的重要指標(biāo)。結(jié)果表明四逆湯與缺甘草四逆湯對MI-RI模型對H9c2心肌細(xì)胞造成的損傷均具有明顯的保護(hù)作用,且前者保護(hù)作用更加顯著。四逆湯對H9c2心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用更強,一個重要原因是四逆湯能通過調(diào)節(jié)LDH,CK等指標(biāo)的水平及減少MI-RI所致的心肌細(xì)胞的凋亡可挽救更多的心肌的作用,起到緩解心肌細(xì)胞壞死的發(fā)生,提高M(jìn)I-RI的治療效果。通過對代謝組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析,17個潛在代謝標(biāo)志物中,乳酸鹽、果糖、葡萄糖、甘露糖和3-磷酸甘油與糖酵解途徑相關(guān),這表明四逆湯(缺甘草與否)對缺血再灌注損傷H9c2心肌細(xì)胞的保護(hù)作用是通過調(diào)節(jié)與糖酵解的途徑來實現(xiàn)的。MI-RI模型損傷,因為H9c2心肌細(xì)胞缺血缺氧使有氧代謝發(fā)生障礙,能量供應(yīng)以糖酵解為主,通過糖酵解生成乳酸;同時,H9c2心肌細(xì)胞模型組的LDH活性顯著升高,也表明乳酸含量升高的必然性。這一點與之前心肌細(xì)胞損傷的病理生理變化的研究結(jié)果相吻合。葡萄糖和甘露糖含量顯著降低是因為造模后的心肌細(xì)胞在缺血缺氧的環(huán)境下,完全通過糖酵解來獲得能量所致;果糖的含量稍有升高,可能是在復(fù)氧的情況下,恢復(fù)葡萄糖的有氧代謝,使部分葡萄糖轉(zhuǎn)化為果糖,而心肌細(xì)胞無法完成果糖的糖異生過程所致。MI-RI模型組中3-磷酸甘油的含量顯著升高,可能因為在缺血缺氧條件下果糖與甘露糖等己糖轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油酸所致。棕櫚酸與硬脂酸2種不飽和脂肪酸的含量顯著降低,可能因為在缺血缺氧條件下,葡萄糖的無氧酵解使葡萄糖僅在有氧氧化生成乙酰CoA的含量降低,從而致使以乙酰CoA為合成原料的棕櫚酸與硬脂酸的含量顯著下調(diào)。纈氨酸與異亮氨酸屬支鏈氨基酸,作為心肌缺血時心臟可供選擇的重要能量底物,心肌細(xì)胞在缺血缺氧情況下,利用支鏈氨基酸作為代償性的能量供給,致使二者在MI-RI模型組中的含量顯著降低。亮氨酸、甘氨酸、蘇氨酸和脯氨酸的含量水平顯著降低,這些α-氨基酸作為能量代謝的重要前體及能轉(zhuǎn)化為一些生物分子,其相對含量的變化可能與心肌細(xì)胞在MI-RI過程中對能量的需求而應(yīng)激調(diào)節(jié)的結(jié)果。尿素的含量顯著升高,可能與上述幾種氨基酸的代謝使尿素的含量有所積蓄有關(guān)。與MI-RI模型組相比,四逆湯組和缺甘草四逆湯組除甘露糖外,分別將乳酸等12種代謝物的含量進(jìn)行了不同程度的回調(diào)。從相對含量分析四逆湯組和缺甘草四逆湯組間的差異主要表現(xiàn)如下。乳酸、谷氨酰胺與葡萄糖的含量在附子的3種雙酯型生物堿的毒性代謝組學(xué)分析結(jié)果是血漿中乳酸鹽的水平升高,葡萄糖和谷氨酰胺的含量下降;缺甘草四逆湯組中乳酸和谷氨酰胺的回調(diào)幅度較四逆湯組回調(diào)的幅度明顯減小,而葡萄糖的回調(diào)幅度則過大,甚至超過了空白對照組的含量水平。3種雙酯型生物堿分別對血漿中葡萄糖含量的影響有高有低不盡相同,本研究結(jié)果可能是由于四逆湯缺甘草方中復(fù)雜成分總體的調(diào)節(jié)作用使葡萄糖含量水平顯著升高。以上均