頂空-固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜種群頻度分析技術(shù)聯(lián)用技術(shù)研究醬油香氣組成

頂空-固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜種群頻度分析技術(shù)聯(lián)用技術(shù)研究醬油香氣組成

柴油采用大豆、豆瓣菜、小麥、炒餅、水和鹽，通過美曲霉等微生物發(fā)酵酶分解、酶促和非酶促棕褐色變化作用。醬油起源于中國,是東南亞地區(qū)的傳統(tǒng)調(diào)味品,以其獨(dú)特的風(fēng)味深受世界各地消費(fèi)者的喜愛。據(jù)研究報道,醬油中的風(fēng)味成分有超過300種,高獻(xiàn)禮等用固相微萃取(SPME)和直接溶劑萃取(DSE)方法共檢測出傳統(tǒng)中式醬油的152種揮發(fā)性化合物,嚴(yán)留俊和張艷芳等通過SPME法分別鑒定出日式醬油和低鹽固態(tài)發(fā)酵醬油的97和82種揮發(fā)性化合物[3~4]。氣相色譜-嗅聞檢測技術(shù)(GC-O)以人的鼻子作為檢測器,能有效地在眾多揮發(fā)性化合物中找到真正對食品風(fēng)味有貢獻(xiàn)的活性化合物,因此,近年來被廣泛應(yīng)用于食品研究中。其常用的前處理方法有同時蒸餾萃取法(SDE)、直接溶劑萃取法(DSE)、溶劑輔助蒸餾萃取法(SAFE)和頂空-固相微萃取法(HS-SPME)。目前研究醬油風(fēng)味活性物質(zhì)多采用液體進(jìn)樣的方式,Steinhaus等用SAFE與GC-MS/O聯(lián)用,Kaneko等通過大孔吸附樹脂與溶劑萃取結(jié)合的方法,分別鑒定出多種醬油的香氣活性物質(zhì),包括3-甲基丁醛,3-羥基-4,5-二甲基-2(5H)-呋喃酮(sotolone),HEMF,HDMF,2-甲基丁醛,3-甲硫基丙醛,乙醇和異丁酸乙酯等[5~7]。然而,GC-MS液體進(jìn)樣時為了保護(hù)質(zhì)譜不受過高濃度的溶劑損害,延遲質(zhì)譜的檢測時間,導(dǎo)致GC-MS譜圖不完整及部分化合物的缺失。另外,溶劑萃取的過程易造成樣品中部分低沸點(diǎn)組分的損失,且萃取需用大量有機(jī)溶劑,不環(huán)保,與之相比,HS-SPME無需溶劑,集采樣、萃取、進(jìn)樣于一體,靈敏度高,選擇性好,能夠與氣相色譜-質(zhì)譜直接聯(lián)用,方便快捷地分離鑒定食品中的風(fēng)味物質(zhì)。近年來已有學(xué)者通過SPME和GC-MS/O聯(lián)用的方法測定豆醬、開心果和中草藥等的風(fēng)味活性化合物[8~10]。本文以市售醬油為原料,通過頂空-固相微萃取和氣相色譜-質(zhì)譜-嗅聞檢測技術(shù)聯(lián)用(HS-SPME-GC-MS/O),高效、準(zhǔn)確、環(huán)保地分離鑒定醬油的風(fēng)味活性物質(zhì),并對其進(jìn)行定性、定量分析,通過比對GC-O實(shí)驗結(jié)果與定量數(shù)據(jù),確定其中的關(guān)鍵香氣活性物質(zhì)對醬油整體風(fēng)味的貢獻(xiàn)。1材料和方法1.1原材料市售日式醬油(龜甲萬濃口大豆醬油)購于廣州超市,儲藏于4℃待測。1.2水質(zhì)和質(zhì)譜聯(lián)用儀固相微萃取頭,75μmCAR/PDMS;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,DSQII,美國Thermo公司;三合一自動進(jìn)樣器,ODOII嗅聞儀,澳大利亞SGE公司。1.3hdmf介紹標(biāo)準(zhǔn)品:3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、苯乙醛、3-甲基丁酸、3-甲硫基丙醛、2-乙?；量?、異丁酸乙酯、HEMF購于Sigma(上海)有限公司;HDMF購于Fluka(上海)有限公司;3-甲基丁醇、2-甲基丁醇、1-辛烯-3-醇、苯乙醇、2-甲基丙醛、2-甲基丁酸、丁酸乙酯、異戊酸乙酯、苯甲酸乙酯、苯乙酸乙酯、4-乙基愈創(chuàng)木酚、二甲基硫醚、二甲基三硫、苯咗呋喃,2,5-二甲基吡嗪、2-乙基-3-甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪購于阿拉丁試劑公司。其他試劑均為分析純,購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。1.4實(shí)驗方法1.4.1car/pdms萃取將8mL醬油樣品,20μL內(nèi)標(biāo)(1.724mg/L的2-甲基-3-庚酮甲醇溶液)以及1g氯化鈉加入20mL頂空進(jìn)樣瓶中。45℃下保溫平衡20min后,用75μmCAR/PDMS萃取頭在45℃下萃取40min,萃取結(jié)束后在GC進(jìn)樣口250℃下解析3min。兩個樣品間萃取頭270℃老化10min,以防止樣品間相互污染。1.4.2高純血酸鹽分離/自然權(quán)利分離樣品分別通過TR-5ms彈性石英毛細(xì)色譜柱(30m×0.25mm×0.25μm)和TR-wax彈性石英毛細(xì)色譜柱(30m×0.32mm×0.25μm)進(jìn)行分離;程序升溫條件為起始溫度40℃,以5℃每分鐘升到120℃,保持2min,再以7℃每分鐘升至220℃,保持5min;載氣為高純氦氣(1.0mL/min);分流比10:1。質(zhì)譜條件:電子轟擊電離(EI)離子源,電子能量70eV;電子倍增器電壓350V;離子源溫度230℃;傳輸線溫度250℃;質(zhì)量范圍35~350m/z;掃描速度3.00scans/s。1.4.3gc-o中的品種嗅聞儀以3mL/min的氦氣為載氣,輔以水蒸氣,緩解感官評價人員因鼻黏膜干燥而導(dǎo)致的不適,通過對嗅聞儀的傳輸管路加熱以防止化合物在管路中冷凝。GC-O實(shí)驗由三個有經(jīng)驗的感官評價人員完成,每名評價人員對每個樣品至少嗅聞3次。感官評價人員在嗅聞過程中描述香氣化合物的氣味特征及強(qiáng)度(1=微弱的,可識別的味道;2=清晰,但不強(qiáng)烈的味道;3=強(qiáng)烈的味道),只有被兩名以上的評價人員嗅聞到的化合物才能被確定為風(fēng)味活性物質(zhì)。1.4.4揮發(fā)性香氣活性物質(zhì)的分析方法化合物的鑒定根據(jù)NIST08數(shù)據(jù)庫,對比標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)RI并參考相關(guān)文獻(xiàn)完成,化合物的保留指數(shù)(RetentionIndex,RI)通過正構(gòu)烷烴(C6-C26)計算得到。通過內(nèi)標(biāo)(2-甲基-3-庚酮)對醬油中所有揮發(fā)性香氣物質(zhì)進(jìn)行半定量分析(響應(yīng)因子=1),另外,采用GC-O嗅聞法鑒定出的醬油關(guān)鍵香氣活性物質(zhì),用內(nèi)標(biāo)結(jié)合外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法對其進(jìn)行定量分析,方法參考馮云子等,沒有標(biāo)準(zhǔn)品的化合物用分子量相近、官能團(tuán)相同、極性相似的化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計算。氣相色譜-質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用Xcalibur軟件(版本2.0)分析處理。2結(jié)果與討論2.1發(fā)酵配方中酯類化合物的檢測通過HS-SPME-GC-MS方法分離鑒定出醬油中風(fēng)味化合物109種,其中包括酸(5種)、醛(8種)、酮(11種)、酯(19種)、醇(14種)、酚(6種)、吡嗪(9種)呋喃酮(15種)、含硫化合物(10種)及其他類(12種),如表1所示。風(fēng)味化合物中醇類物質(zhì)的含量最高,占揮發(fā)性化合物總含量的75.82%,醬油中醇類物質(zhì)一部分是酵母轉(zhuǎn)化相關(guān)的醛類物質(zhì)而生成,另有部分源自氨基酸和糖類物質(zhì)在有氧條件下的反應(yīng)。在檢出的14種醇類物質(zhì)當(dāng)中,乙醇含量占54.49%,這與孫舒揚(yáng)、嚴(yán)留俊等對高鹽稀態(tài)醬油風(fēng)味的研究結(jié)果類似。一些雜醇類物質(zhì)也具有風(fēng)味活性,如:苯乙醇(5.12%),3-甲基丁醇(3.65%)和2-甲基丁醇(2.57%),它們被認(rèn)為是醬醪發(fā)酵過程中苯丙氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解產(chǎn)生的,本實(shí)驗結(jié)果和Steinhaus,Giri等的相吻合。另外,2,3-丁二醇的兩個同分異構(gòu)體共占了揮發(fā)性化合物總量的6.43%,曾經(jīng)被認(rèn)為是豆瓣醬和醬油的風(fēng)味活性化合物,然而在本實(shí)驗中,它們并沒有被嗅聞到。醬油中共檢測出8種醛類物質(zhì),其中2-甲基丙醛(0.91%),2-甲基丁醛(2.65%),3-甲基丁醛(2.98%)和苯乙醛(0.60%)是香氣活性物質(zhì)。醛類物質(zhì)是游離氨基酸在微生物作用下脫氨和去羰基反應(yīng)生成,也有研究認(rèn)為醛類物質(zhì)的生成與美拉德反應(yīng)有關(guān)。另外,有11種酮類物質(zhì)被檢測出來,只有1-辛烯-3-酮被鑒定出具有香氣活性,其味道和1-辛烯-3-醇一樣,都被認(rèn)為是蘑菇香味。酯類物質(zhì)廣泛存在于發(fā)酵食品中,揮發(fā)性高且閾值通常較低,極易被人的嗅覺感受器所感知,因此對食品風(fēng)味組成起著極其重要的作用。本文檢測出19種酯類化合物(5.72%),僅次于醇類、醛類物質(zhì)。乙酸乙酯(1.62%),乳酸乙酯(1.98%)是含量最高的兩種酯類物質(zhì),但并未被嗅聞到,這可能與其水中閾值(5000μg/L)較高有關(guān)系。而部分閾值較低的酯類化合物,如異丁酸乙酯(0.06%)、丁酸乙酯(0.06%)、異戊酸乙酯(0.04%),2-甲基戊酸乙酯(0.01%),4-甲基戊酸乙酯(0.01%),苯乙酸乙酯(0.47%)和乙酸苯乙酯(0.07%)在GC-O實(shí)驗中檢出,被描述為果香或花香味。乙酯類物質(zhì)與醬油釀造中酵母發(fā)酵作用有密切關(guān)系,酵母降解脂質(zhì)產(chǎn)生大量醇和酸發(fā)生酯化反應(yīng),日式醬油較長的低溫發(fā)酵階段及大量的酵母更促進(jìn)了酯化反應(yīng)的進(jìn)程。檢出的五種酸類物質(zhì)占醬油總揮發(fā)性化合物的3.76%,乙酸、3-甲基丁酸和3-甲基戊酸都是具有香氣活性的,是醬油中酸味的重要貢獻(xiàn)化合物,多數(shù)豆類發(fā)酵食品如:醬油、豆醬、腐乳等都會含有乙酸、3-甲基丁酸、2-甲基丁酸等,并被認(rèn)為對食品風(fēng)味體系有酸味、奶酪味的貢獻(xiàn)。值得注意的是,煙熏味和焦糖香是醬油風(fēng)味組成的兩類重要味道。以愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚和4-乙烯基愈創(chuàng)木酚為代表的煙熏味、熏烤味香氣化合物在醬油中含量很低(0.31%,0.41%,0.11%),但這些酚類通常被認(rèn)為是醬油中較為重要的香氣物質(zhì)。它們的香氣強(qiáng)度評分≥2.7,為醬油貢獻(xiàn)濃烈的煙熏香。醬油發(fā)酵過程降解木質(zhì)素糖苷產(chǎn)生酚類物質(zhì),而釀造醬油原料中的谷物麩皮則是木質(zhì)素最大的來源,多數(shù)研究認(rèn)為,甲氧基酚類貢獻(xiàn)的煙熏味對醬油整體風(fēng)味有積極作用,且醬油加熱能一定程度提升煙熏味。而日式醬油中焦糖香的主要來源是HEMF,HDMF,2-乙?；量┖?-羥基-2-甲基-4-吡喃酮(maltol)。本實(shí)驗檢出的HDMF(0.14%),HEMF(0.04%),2-乙酰基吡咯(0.63%)和maltol(0.08%)雖然峰面積比例很小,但卻有1.3-3.0的香氣強(qiáng)度評分。HEMF俗稱醬油酮,是醬油中最重要的風(fēng)味活性物質(zhì),Steinhaus等和Kaneko等采用芳香萃取物稀釋分析法(AEDA)對醬油活性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行研究,HEMF和HDMF的FD稀釋因子均為最高。醬油發(fā)酵過程中,HEMF和HDMF主要通過乳酸菌磷酸戊糖途徑由美拉德反應(yīng)的某些中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化而成[14~15]。含硫化合物在醬油中的含量很低(0.76%),但卻對整體風(fēng)味有很大影響。它們來自含硫氨基酸、肽等的降解,在水中的閾值很低,如3-甲硫基丙醛(1.4μg/kg),甲硫醚(1.1μg/kg),二甲基三硫(0.016μg/kg),含硫化合物通常會有土豆味、洋蔥味、硫磺味等,多次在醬油、豆瓣醬等發(fā)酵食品中檢測到[13~14],而甲硫醚和5-甲基-2-呋喃甲硫醇是首次在醬油中被確認(rèn)具有香氣活性。吡嗪也是一類含量較低的物質(zhì)(0.91%),檢測到的9種吡嗪中,2,6-二甲基吡嗪,三甲基吡嗪和3-乙基-2,5-二甲基吡嗪呈現(xiàn)出玉米、巧克力般的味道,與文獻(xiàn)報道的堅果香,焦香味類似。2.2克氏原螯蝦風(fēng)味成分分析香氣活性值(Odoractivityvalue,OAV)是評價香氣化合物重要性的一個指標(biāo),GC-O實(shí)驗得到的結(jié)果很可能因為香氣化合物之間的相互作用或者食品基質(zhì)的影響而產(chǎn)生誤差,而OAV值通過計算化合物濃度和在該食品體系中閾值的比值,可以消除這一誤差。一般認(rèn)為,OAV值大于1則對樣品香氣組成有貢獻(xiàn),OAV值越大,該香氣化合物貢獻(xiàn)越大。醬油的主要成分是水,故本文通過香氣化合物的定量數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)報道該物質(zhì)在水中的閾值計算關(guān)鍵香氣組分的OAV值,結(jié)果如表2所示。從表2可知,3-甲基丁醛(OAV=2215),2-甲基丁醛(OAV=770)和2-甲基丙醛(OAV=559)是風(fēng)味活性物質(zhì)中香氣活性值最高的,它們都是貢獻(xiàn)強(qiáng)烈麥芽香的醛類物質(zhì)。前人對日本醬油和兩種中式醬油的風(fēng)味研究結(jié)果均表明,3-甲基丁醛是其中OAV值最高的香氣化合物。實(shí)驗發(fā)現(xiàn),3-甲基丁醛和2-甲基丁醛是共流出組分,保留時間十分相近,GC-O實(shí)驗中一般只能嗅聞到一個濃烈的麥芽香氣,但由于它們的OAV值均大于700,所以認(rèn)為3/2-甲基丁醛都是對醬油特征香氣有重要貢獻(xiàn)的化合物。此外,本文還檢測出5種OAV值大于90的化合物,分別是3-甲基戊酸(酸臭味,OAV=514),3-甲硫基丙醛(土豆味,OAV=483),4-甲基戊酸乙酯(果香,OAV=351),乙醇(醇味,OAV=147),HEMF(焦糖香,OAV=127)和苯乙醛(花香,OAV=92)。其中3-甲硫基丙醛、HEMF均多次被報道在醬油中檢出,是醬油的關(guān)鍵風(fēng)味化合物,與本研究結(jié)果相符,這兩個化合物不僅具有較大的OAV值,且GC-O嗅聞評分均為3分。同時,乙醇在本研究中被鑒定為OAV=147的重要香氣活性化合物,但前人的研究中少有涉及,原因可能是之前的研究普遍采用液體進(jìn)樣的方法,GC-O實(shí)驗過程為避免有機(jī)溶劑峰對感官評價人員健康造成不良影響而錯過了乙醇峰的流出。3-甲基戊酸在本實(shí)驗中被描述為酸臭味,而此前它在低鹽固態(tài)醬油中被認(rèn)為具有酸香或青草香,4-甲基戊酸乙酯則首次在醬油中被檢出具有香氣活性,這兩個物質(zhì)都是閾值極低的化合物。本實(shí)驗中檢出苯乙醛的OAV=92,這與Steinhaus等對日本醬油的研究結(jié)果相近,但卻兩倍高于馮云子等對中式高鹽稀態(tài)醬油的研究結(jié)果,苯乙醛在嗅聞實(shí)驗中評分為3分,其代表的花香是日式醬油的重要風(fēng)味組成之一。有意思的是,三甲基吡嗪(巧克力香),2,6-二甲基吡嗪(玉米味),苯甲酸乙酯(甜香),苯乙酸乙酯(花香),乙酸苯乙酯(花香)和3-苯基呋喃(甜香)的OAV<1,但它們的香氣強(qiáng)度評分均大于1。香氣活性值分析與GC-O實(shí)驗結(jié)果有一定差異,該現(xiàn)象也在此前的研究中出現(xiàn)過。原因可能是化合物在水中的閾值與其在醬油體系中的閾值有一定偏差,也或許因為香氣化合物在食品基質(zhì)中的協(xié)同與拮抗作用,這些OAV<1的化合物能被感官評價人員聞見很可能