黃芩抗細菌抗真菌作用機制的研究進展

黃芩抗細菌抗真菌作用機制的研究進展

黃鼠狼具有清熱除濕、清火解毒的功效。主要有效成分有黃鼠狼、漢代黃鼠狼、黃鼠狼和漢代黃鼠狼。研究表明,黃芩及其有效成分具有廣泛的藥理作用,如抗炎、抗氧化、抗腫瘤和免疫調節(jié)等,尤以抗細菌/真菌作用最為顯著。本文結合課題組近年來對黃芩有效成分的研究,對國內外近來關于黃芩及其有效成分以及含黃芩的中藥復方的體內外抗菌研究、抗生物膜研究及其可能的作用機制進行綜述。1從中藥中挖掘抗菌活性成分近年來,因為抗生素的濫用,耐藥菌株的產生已成為臨床治療的最棘手問題。研發(fā)新型抗生素需要較長周期,故從中藥中挖掘具有抗菌活性的中藥或有效組分顯得尤為重要。我國豐富的中藥資源中有不少中草藥對細菌有抑制甚至殺滅作用,研究表明,中藥黃芩及其有效組分有顯著的體內外抗菌作用。1.1化藥成分對e.coli和atp的影響大腸埃希菌(Escherichiacoli,E.coli)又稱大腸桿菌,是人和動物腸道內數量最多的一種革蘭氏陰性菌,可導致腸外的化膿性感染和泌尿道感染,少數血清型也可引起胃腸炎。黃芩有較強的抑制E.coli作用。黃衍強等篩選出黃芩等6味中藥具有一定的抑制耐藥性E.coli作用,0.5g·mL-1和1.0g·mL-1的黃芩提取物抗耐藥性E.coli的抑菌圈均大于其他中藥提取物。周雪寧等用瓊脂二倍稀釋法考察了黃芩等3種中藥體外抗產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)E.coli作用,得出黃芩抗E.coli的MIC為31.25g·L-1。王娜觀察到黃芩有效成分黃芩苷對大腸桿菌的MIC為1.56g·L-1,且黃芩苷的抑菌能力高于黃芪皂苷。董春雷等發(fā)現500mg·L-1黃芩素能抑制46.52%的E.coli浮游菌和45.15%生物膜(biofilm)。ChinnamN等認為黃芩素抗E.coli機制可能與阻斷ATP合酶有關。由于E.coli對抗生素容易產生耐藥性,故可嘗試使用黃芩或其有效成分替代治療。1.2不同抗sa藥配伍的藥養(yǎng)作用表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis,Se)是當前院內感染最常見的致病菌,也是假體等骨科內植物周圍感染的主要致病菌。蔣獻等研究了主要成分為黃芩浸膏的“一清膠囊”對Se和痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes,Pra)的體外抑菌作用。實驗顯示黃芩浸膏和膠囊對Se和Pra的MIC分別為1,0.98g·L-1。表明黃芩(“一清膠囊”的主要成分)對Se和Pra均有顯著的抑菌效果。楊志強考察了黃芩等3種中藥水煎劑具有體外抑制Se的作用。另外王坤等認為主要成分為黃芩的雙黃連口服液對細菌生物膜的形成具有抑制效果。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,Sa)是人類的一種重要病原菌,是目前院內感染常見的革蘭陽性菌,易引起化膿性感染。有報道1.25g·L-1的黃芩能100%抑制金黃色葡萄球菌。黃芩及其浸出液對Sa也有較好的抑菌作用,且黃芩對Sa的抑制作用強于痢疾桿菌,抗菌作用介于黃連與黃柏之間,為臨床中藥治療癰腫瘡毒和痢疾提供了實驗依據。陳昌利等發(fā)現黃芩醇提物與蜂毒肽二者配伍可以顯著的抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA),后者對所有與甲氧西林結構相同的β-內酰胺類和頭孢類抗生素均耐藥。體外實驗測得黃芩醇提物對MRSA的最大抑菌圈大于陽性對照;通過觀察動物存活率和各臟器質量來衡量體內抑菌作用,結果表明黃芩醇提物和蜂毒肽配伍有較強的抑制MRSA作用。陳桂紅等研究了中藥黃芩、黃柏提取液及不同配伍體外抗MRSA的作用,實驗中黃芩提取物對MRSA的MIC50為0.75g·L-1。另外發(fā)現,黃芩和黃柏以2∶1配伍對MRSA的MIC50為0.093g·L-1,具有協同抑菌效果。黃暨生等考察了含黃芩等3味中藥的復方體內外抗MRSA的各組均明顯降低小鼠的死亡率,延長小鼠的生存時間,結果為MRSA的治療提供了實驗依據。黃芩素在體外還可抑制Sa生物膜的形成,細菌生物膜的形成會大大降低其對抗生素的敏感性。杜仲業(yè)等通過構建Sa體外生物膜模型,發(fā)現黃芩素干預Sa可明顯減少生物膜,機制或是黃芩素抑制Sa的黏附,進而抑制和殺滅Sa生物膜。黃芩素、黃芩苷不僅單用具有一定的抗菌作用,與抗生素聯用時還能發(fā)揮協同效應。彭青觀察到黃芩素與β-內酰胺類抗生素可協同抗MRSA,顯著降低抗生素的MIC,增加Sa對抗生素的敏感性。推測機制或是黃芩素抑制MRSA耐藥泵的基因表達,干擾自溶酶系統,阻礙相關DNA的復制和蛋白的合成。在陳勇川等的實驗中,16mg·L-1的黃芩素可顯著逆轉MRSA對苯唑西林的高度耐藥性,黃芩苷/黃芩素對MRSA產生青霉素結合蛋白(PBP2a)有明顯抑制作用,表明黃芩苷/黃芩素或是通過抑制MRSA產生PBP2a來逆轉對苯唑西林的耐藥性。黃瑩瑩、Novy等分別觀察到黃芩素與左氧氟沙星、土霉素、四環(huán)素也有協同抗Sa的作用。陳艷等通過構建體外Sa生物膜模型,發(fā)現亞抑菌濃度256mg·L-1的黃芩苷聯合萬古霉素可協同破壞建模3d的Sa生物膜,干預Sa生物膜的形成及發(fā)展。關于作用機制,云寶儀等認為黃芩素能影響Sa細胞膜的通透性、干擾菌體內蛋白質合成、抑制三羧酸循環(huán)和DNA拓撲異構酶Ⅰ和Ⅱ的活性。Krakauer等認為黃芩苷還可阻斷相關信號通路來抑制葡萄糖球菌外毒素(一種超抗原)所誘導的炎性細胞因子釋放從而降低Sa外毒素誘發(fā)的病理損害。1.3抗pa生物膜的作用銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa,Pa)為院內感染重要的條件致病菌之一,當人體免疫力低下時更易感染,且病死率較高。文獻報道黃芩和黃芩牡丹皮提取液對Pa有較強的抑制作用,且黃芩可增加Pa對氨芐西林和頭孢他啶的敏感性,可與五倍子協同抗Pa。黃芩水煎液對Pa生物膜有較強的抑制和破壞作用?？讜x亮以PVC吸痰管為生物膜載體制作Pa體外生物膜模型,銀染后SEM觀察生物膜的形成情況,發(fā)現用藥組幾乎不形成生物膜。另觀察黃芩、頭孢他啶(CAZ)、左氧氟沙星(LFX)對早期生物膜和成熟生物膜的影響,顯示黃芩能破壞Pa早期生物膜和成熟生物膜,且效果相當于紅霉素組。另還發(fā)現黃芩能協同CAZ和LFX抑制、殺滅Pa。譚黎明認為黃芩提取物可以降低小鼠燙傷后感染Pa菌的死亡率,還可提高頭孢他啶對Pa感染的療效。黃芩素、黃芩苷等多種有效成分也具有抗Pa生物膜作用。王貴年等探討了黃芩苷體外抗Pa生物膜的影響。黃芩苷對Pa4458,ATCC27853的MIC分別為15.65,32.25mg·L-1。黃芩苷干預體外構建Pa生物膜模型后,銀染法觀察到活菌數明顯減少。謝林利等發(fā)現32mg·L-1的黃芩苷和2mg·L-1的黃芩素均可以影響Pa的黏附、抑制其形成生物膜,對早期生物膜形成的抑制作用強于對成熟生物膜的作用。Zeng等通過實驗發(fā)現黃芩等在濃度為200μmol·L-1時可抑制Pa生物膜的形成,而黃芩素在20μmol·L-1時即可抑制Pa生物膜的形成,在4~40μmol·L-1時可促進大腸桿菌信號受體TraR蛋白水解。其另一項實驗表明,200μmol·L-1的黃芩素與1g·L-1氨芐西林可表現出協同抗Pa作用。這些結果提示黃芩素的抗菌作用或涉及了Pa群感效應系統,有望開發(fā)成新型抗菌藥。Brackman等發(fā)現黃芩苷在體內外能作為群感效應抑制劑(quorumsensinginhibitors,QSI)提高抗生素對細菌生物膜的抑制作用。針對體外構建的Pa生物膜模型,黃芩苷與妥布霉素(TOB)聯用可以明顯抑制其生物膜形成,但并不能增加突變菌株對TOB的敏感性。1.4對推進hp的作用幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,Hp)是慢性胃炎和消化性潰瘍甚至胃癌等疾病的主要誘因。目前根除Hp的治療是以抗生素為主的“三聯”或“四聯”療法。文獻報道黃芩、黃芩醇提物和黃芩苷體外有抗Hp活性,黃芩對Hp的MIC為3.9mg·L-1,黃芩苷和黃芩醇提物對Hp的MIC90分別為1.30,3.26g·L-1[40-41]。由黃芩等配伍的中藥復方也具有較強的抗Hp作用。陸為民等在研究中發(fā)現,由黃芩等3味中藥配伍的益氣清熱方能顯著的抑制Ⅰ型Hp(Hp分為高毒力株Ⅰ型和低毒力株Ⅱ型)。體內實驗表明益氣清熱方可以明顯緩解Ⅰ型Hp感染后小鼠體重的下降,使胃系數降低。王小娟等研究的含黃芩等的中藥復方滅幽湯能夠改善胃黏膜炎癥細胞浸潤,抑制Hp的生長且有助于修復胃黏膜。采用HE染色法觀察結果顯示滅幽湯組Hp陽性率和胃黏膜炎癥程度明顯低于模型組和陽性對照組。ShiH等研究了三黃瀉心湯(SHXT)及其主要組分黃芩苷對幽門螺桿菌感染胃上皮AGS(胃腺癌細胞)細胞的影響。結果表明SHXT(50,100,200mg·L-1)和黃芩苷(0.1,1,10μmol·L-1)雖然不影響Hp的生長曲線,但熒光定量PCR(RT-PCR)結果顯示SHXT與黃芩苷可抑制AGS細胞IL-8和COX-2表達、IκBα的分解。其另一項實驗顯示SHXT和黃芩苷組可下調iNOSmRNA的表達,減少NO產生和p50的轉移。王成喜等觀察黃芩聯合埃索美拉唑治療Hp感染明顯優(yōu)于西藥三聯療法,且可以機體增強免疫力,聯合抑酸藥可以清除Hp。在其后期研究中發(fā)現,黃芩、黃芪聯合埃索美拉唑根除Hp有較好的效果,副作用小,提示中藥黃芩具有潛在替代抗生素的價值。1.5黃愛芹、乙醇回流法提取的抗菌藥效關系腸炎沙門氏菌(Salmonellaenterica,Se)是引起急性胃腸炎的主要病原菌,黃愛萍考察了黃芩水煮法和乙醇回流法提取的有效成分抗Se作用,發(fā)現黃芩乙醇回流提取液比水煮液抑菌作用強。Lu等也發(fā)現黃芩醇提物有抗菌作用。實驗表明12.5g·L-1的黃芩醇提物對腸炎沙門菌表現出一定程度的抗菌或殺菌作用。1.6保肝作用的分離和誘導結核分枝桿菌(M.tuberculosis,Mtb)是引起結核病的病原菌。周清通過實驗測得黃芩苷抗Mtb的MIC50和MIC90分別為6,12g·L-1。電鏡觀察黃芩苷作用Mtb細胞后,結核桿菌皺縮變形、菌壁消失、胞膜部分降解、胞質疏散、核糖體顆粒少、絲狀DNA消失、電子密度降低。提示黃芩苷抑制Mtb的作用機制或是通過對細胞壁、細胞膜的破壞而達到抑菌作用。鄺棗園等通過體外構建人臍靜脈內皮細胞(ECV-304)模型探討黃芩苷干預肺炎衣原體(CPN)感染細胞的機制。RT-PCR檢測感染CPN的細胞無TLR4mRNA表達,TLR2表達較正常組提高,0.24g·L-1的黃芩苷干預感染CPN的細胞后TLR2表達下調。提示被CPN感染的ECV-304細胞可由TLR2介導應激,而黃芩苷可以抑制CPN所刺激TLR2的高表達。肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae,Mp)可引起呼吸道疾病和全身性病變,是肺炎的常見病原體。孫艷平發(fā)現黃芩提取物對Mp的MIC為0.97~3.90g·L-1。該課題組還采用亞抑菌濃度的黃芩苷和大環(huán)內酯類藥物體外誘導Mp,實驗結果發(fā)現Mp菌株經黃芩苷誘導后不產生耐藥性,而經紅霉素、阿奇霉素誘導后均產生耐藥和不同程度的交叉耐藥。沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis,Ct)可致失明、不孕癥、異位妊娠和骨盆炎癥等疾病。Hao等實驗測得黃芩苷體外抗Ct的MIC50為0.50mmol·L-1。由于衣原體蛋白酶樣活性因子(CPAF)參與降解宿主轉錄因子(RFX5),RT-PCR和Westernblot檢測了RFX5,CPAFmRNA和衣原體感染細胞蛋白的表達,結果表明黃芩苷干預可上調RFX5表達,下調CPAF,提示CPAF或是黃芩苷作用的主要靶標。市售的熊膽黃芩滴眼液主要成分之一為黃芩苷,對沙眼及病毒性眼病有良好的治療作用。腸球菌(Enterococcus)廣泛存在與人和動物腸道,為院內感染的重要病原菌,由于其固有耐藥和獲得性耐藥使得治療更加困難。Chang等認為2~16mg·L-1的黃芩素與慶大霉素體外可以協同抗耐萬古霉素的腸球菌。Time-kill實驗結果顯示32mg·L-1的黃芩素抑菌作用持續(xù)12h時,當濃度為64mg·L-1時抑制作用持續(xù)至36h。鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii,Ab)為院內感染重要病原菌,可引起敗血癥、呼吸道感染等,隨著Ab感染增多其耐藥性也日益嚴重。Miyasaki等發(fā)現黃芩有效成分去甲漢黃芩素抗多耐藥Ab的MIC為128mg·L-1,MBC為256mg·L-1。2黃從細胞培養(yǎng)、活性及混養(yǎng)劑的用量對ca有顯著影響近年來念珠菌引起的真菌感染病例不斷增多,在院內獲得性感染中居第4位,其死亡率高達40%,尤以白念珠菌(Candidaalbicans,Ca)感染率最高。臨床常用的抗真菌藥物毒副作用大,且易產生耐藥性,因而尋找抗真菌中藥具有重要臨床意義。黃芩及其不同提取物對Ca均有較好的抑菌效果,為臨床治療真菌深部感染提供了新的手段。有文獻報道,黃芩乙醇提取液對耐氟康唑Ca標準株和都柏林念珠菌的MIC為7.8~15.6g·L-1。Wong等發(fā)現黃芩水提物對Ca12和ATCC28367的MIC分別為5,2.5g·L-1,且可抑制熱帶念珠菌。對于黃芩有效成分黃芩素、黃芩苷、漢黃芩素、野黃芩苷的抗菌活性檢測,以黃芩素的白念珠菌抑制作用最強(MIC25mg·L-1)。黃芩素可誘導白念珠菌凋亡,協同氟康唑抗耐藥白念珠菌。Huang等認為黃芩素能顯著提高氟康唑的抗真菌作用(FICI=0.039)。黃杉探討了黃芩素抗Ca的作用機制,實驗發(fā)現1~2mg·L-1的黃芩素可有效抑制Ca,兩藥合用可使得耐氟康唑菌株變得敏感,表現為顯著的協同作用。激光共聚焦顯微鏡(CLSM)觀察提示黃芩素可抑制Ca生物膜的形成,機制可能是通過下調CSH1(細胞表面疏水性基因)的mRNA表達,降低細胞表面疏水性。流式細胞儀測得胞內活性氧(ROS)增加,線粒體膜電位(MMP)下降,或由黃芩素引起CAP1基因表達下調導致細胞凋亡。Dai等觀察到4mg·L-1的黃芩素可使10%細胞凋亡,觀察到染色質固縮、核碎裂,32mg·L-1黃芩素干預使得胞內ROS水平相對于對照組提高4倍,與氧化還原相關基因(CAP1,SOD2,TRR1)表達均有不同倍數的上調。Cao等研究發(fā)現16mg·L-1的黃芩素體外能顯著抑制Ca的生物膜形成。正常的生物膜具有高疏水性(CSH)的特質,黃芩素能明顯降低CSH。RT-PCR檢測CSH1表達水平明顯下降。Serpa等發(fā)現黃芩素抗6株念珠菌的MIC50為13~104mg·L-1,明顯降低菌株活力。掃描電子顯微鏡(SEM)顯示MIC50黃芩素干預酵母細胞,能抑制其產生豐富的細胞外基質和形成生物膜樣結構。Lee等發(fā)現,黃芩素介導錳超氧化物歧化酶抗氧化應激,有保護線粒體作用。Kang等認為黃芩素對克魯斯念珠菌(Candidakrusei,Ck)有抑制作用。實驗測得黃芩素體外抗Ck的MIC為2.7mg·L-1。黃芩素可降低Ck細胞MMP。提示黃芩素抑菌機制或是通過干擾線粒體內穩(wěn)達到抑菌效果。Fu等認為黃芩素與兩性霉素B(AmB)能協同加速Ca凋亡。實驗對30株臨床菌株進行協同實驗,發(fā)現FICI均值為0.053。二者聯用細胞死亡89%,ROS水平為單用AmB的3倍。實時定量熒光PCR(qRT-PCR)顯示黃芩素能顯著提高半胱天冬酶活性和CaMCA1的表達。熊英等實驗發(fā)現黃芩苷對Ca的MIC和最低殺菌濃度(MFC)為1.0~2.0g·L-1。另行同位素前體摻入試驗,發(fā)現黃芩苷能明顯的抑制[3H]-TdR,[3H]-UdR和[3H]-亮氨酸參入Ca,推測黃芩苷或是通過抑制Ca的基因、蛋白質生物合成來起到抑菌作用。張美玲等研究了甘肅黃芩的有效成分對Ca的抑制作用,結果顯示黃芩素對Ca抑制作用強于黃芩苷。本課題組認為一定濃度的黃芩苷能有效抑制Ca芽管的形成及黏附性。實驗發(fā)現100mg·L-1的黃芩苷對芽管抑制率與兩性霉素B作用