柴胡疏肝散對肝氣郁結(jié)證模型大鼠尿液代謝組學的影響

柴胡疏肝散對肝氣郁結(jié)證模型大鼠尿液代謝組學的影響

肝氣郁結(jié)證是中醫(yī)臨床常見病。幾十年來，中醫(yī)對肝氣郁結(jié)證的本質(zhì)進行了研究。其生物學基礎(chǔ)一直是研究的重點，但肝氣郁結(jié)證不能整體研究。我們運用代謝組學技術(shù),從整體上研究肝氣郁結(jié)證模型大鼠尿液代謝組學變化及柴胡疏肝散對它們的影響。1材料和方法1.1自由飲水,國內(nèi)飲水30只SD大鼠,由華中科技大學動物實驗中心提供,清潔級,雄性,體重為(220±28)g,自由飲水進食。30只大鼠隨機分為3組:正常組10只(A組)、模型組10只(B組)和給藥組10只(C組),正常組和模型組大鼠每天按10ml/kg生理鹽水灌胃,給藥組大鼠每天按10ml/kg柴胡疏肝散水煎液灌胃。1.2儀器和檢測儀器重水(D2O)由中國科學院物理與數(shù)學研究所進口分裝,三甲基硅烷基丙酸(TSP)為加拿大默克公司產(chǎn)品;K2HPO4,NaH2PO4,Na2HPO4,疊氮鈉為上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品;AVANCE400M型超導(dǎo)傅立葉變換核磁共振波譜儀(NMR)為德國布魯克公司產(chǎn)品。離心機為德國EppendorfMinispinPIUS產(chǎn)品;低速臺式離心機TDZ4B-WS為賽特湘離心機儀器公司產(chǎn)品;數(shù)控超聲波清洗器KQ-100DV為昆山超聲儀器有限公司產(chǎn)品;液氮罐YDS(揚州廣陵化玻公司),移液器(德國Eppendorf),5mm核磁管(美國BD公司),電子天平DT500(常熟市百靈天平儀器有限公司)。1.3止血鉗夾鼠的成網(wǎng)造模方法參照須惠仁等的方法建立,模型組與給藥組大鼠分別置于同籠,用紗布包裹尖端的止血鉗夾鼠尾巴,因為疼痛,與其他大鼠撕打會很快激怒全籠的大鼠。夾尾每次刺激30分鐘,每隔3小時1次,每天刺激4次,每天輪換刺激不同大鼠,激怒刺激10天后進行實驗指標檢測。1.4大鼠尿標本制備分別于造模開始前1天和第10天用代謝籠收集24小時尿液。分別收集正常組、模型組、給藥組大鼠尿液標本3ml,室溫下,存于接尿管(內(nèi)加500μl濃度為1mmol/L疊氮鈉)中,接尿管置于冰中保持低溫,新鮮尿液離心溫度20℃,7000rpm,離心10分鐘,去除固體雜質(zhì)。用EP管收集上層2ml尿液,離心后分裝置于-76℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.5待測溶液的配制尿液標本常溫解凍后,從每份尿液向編號后的離心管中分別依次加入400μl尿液,加入188μl磷酸鹽/D2Obuffer(0.2ml)、Na2HPO4(0.0116g)、NaH2PO4(0.0012g)、TSP(0.0001g),pH7.4,并加TSP10μl為內(nèi)標(MTSP=1×10-3mol/L)配成待測溶液。充分震蕩混勻后,樣品靜置10分鐘再于4℃、13000rpm低溫離心10分鐘,取上層清液550μl置于5mm核磁管中,準備進行AVANCE400M型超導(dǎo)傅立葉變換NMR測試。1.6預(yù)處理nmr譜圖在超導(dǎo)傅立葉變換NMR上調(diào)用相關(guān)NOESY譜脈沖序列,設(shè)置參數(shù),然后進行采樣,得到自由感應(yīng)衰減(FID)信號。設(shè)置主要參數(shù):預(yù)飽和方式抑制水峰,預(yù)飽和時間(satdly)為2秒,預(yù)飽和功率(satpwr)為2,掃描譜寬(swh)為9615Hz,采樣數(shù)據(jù)點數(shù)(np)為65536(64k),累加次數(shù)(ns)為128,然后開始采樣,得到FID信號。譜圖處理:將得到的FID信號通過32k傅立葉變換及校正相位和基線等轉(zhuǎn)換為1H-NMR譜,得到3組大鼠在造模前1天、第10天不同時間點的尿液代謝產(chǎn)物1H-NMR譜圖。分段積分:以TSP為化學位移參考峰的位置,設(shè)為0ppm,調(diào)用NMR中的程序?qū)?H譜按默認值,從9.5m到0.05m,每段為0.04ppm,進行分段積分。為了避開水峰對譜圖造成的影響,水峰附近的區(qū)域(4.2~5.2)將被去除,最后將積分數(shù)據(jù)按樣品編號、時間編號用Excel文件儲存,以便進行NMR數(shù)據(jù)數(shù)字化處理。將積分數(shù)據(jù)歸一化后,保存,以備主成分分析(prineipalcomponentsanalysis,PCA)時使用。1.7大鼠陰道代謝組分的分析方法主成分分析法(PCA)分析。將積分值進行中心化和比例換算,用SIMCA-P10.0軟件包(瑞典,UmetricsAB,Umea)進行多變量統(tǒng)計學分析,用PCA求出主成分(principalcompo-nents,PC),利用PC對各組大鼠尿液的代謝組分進行分析。2結(jié)果2.1地u業(yè)已來也活模型組大鼠毛發(fā)稀松,行動遲緩,活動量減少,不活潑,大便次數(shù)增多,色淺、松散而特臭,性情煩躁,容易激惹,叫聲尖細,胡須凌亂;而正常組大鼠毛發(fā)光澤,行動快捷,飲食、大便均正常。2.21造模前后大鼠的考慮圖1為3組大鼠尿液典型的1H-NMR譜,可以看出正常組與模型組之間1H-NMR譜有明顯差別,說明造模后大鼠的內(nèi)源性代謝譜發(fā)生了明顯的變化,模型組與給藥組之間1H-NMR譜有明顯差別,說明經(jīng)給藥后大鼠的尿液代謝譜發(fā)生了變化,可以初步判斷大鼠給藥前后尿液組成的成分和比例上有明顯的變化。2.3模型大鼠尿酸及肌酸含量的變化對1H-NMR譜峰積分值進行PCA分析后,得到PCA得分圖。正常組與模型組PCA有明顯區(qū)別,可見標本的PC積分值分別集中分布于橢圓形散點圖(95%的置信區(qū)域內(nèi))的4個區(qū)域中,兩組均能互相區(qū)分開來,并且互不重疊,說明兩組的代謝表型有差異(圖2);模型組與給藥組區(qū)分明顯(圖3),互不重疊;正常組與給藥組沒有顯著差異(圖4)。對1H-NMR譜峰積分值進行PCA分析后,得到因子載荷圖,從兩兩比較的PCA因子載荷圖(圖5、圖6)可見,少數(shù)點遠離原點,大多數(shù)點集中在原點附近,正是這些遠離原點的化學位移所代表的化合物造成了各組間差異。對PC1及PC2的進一步分析,并對其主要代謝物組的1H-NMR譜化學位移進行歸屬。對1H-NMR譜化學位移進行歸屬,通過譜庫驗證,根據(jù)原始圖譜的信號峰和判別分析因子載荷圖的貢獻度,共同分析得出其濃度的組間差異,以上數(shù)據(jù)表明:與正常組相比,模型組大鼠尿液馬尿酸3.97、7.55、7.85,α-酮戊二酸3.01、2.45,檸檬酸2.57、4.10、2.88,異檸檬酸3.99、2.51、2.43和烏頭酸3.77、6.96、3.96的譜峰相對積分面積明顯減少,在尿液中含量降低;肌酸酐3.05、4.07,丙酮2.23,乙酸1.93,肌酸3.93、3.03,煙酸4.41、1.41和5-羥基吲哚-3-乙酸3.03、2.91、6.63、7.15的譜峰相對積分面積明顯增高,在尿液中的含量顯著升高。給予柴胡疏肝散灌胃干預(yù)后,給藥組大鼠尿液肌酸3.93、3.03,丙酮2.23,肌酸酐3.05等含量明顯下降;N-氧化三甲胺、TMAO、?；撬岬群棵黠@增高,其尿液代謝表型有向正常范圍回歸的趨勢,呈現(xiàn)代謝網(wǎng)絡(luò)修復(fù)的結(jié)果。3中藥在臟器代謝中的應(yīng)用機體正常的生理狀態(tài)是靠各代謝途徑之間相互制約而形成的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)維持的,疾病狀態(tài)可以看成是正常生理平衡被打破、超過機體自身調(diào)節(jié)能力范圍的一種非平衡狀態(tài),藥物的使用就是要使這種失衡狀態(tài)回復(fù)到原始的平衡狀態(tài)或達到一個新的平衡。疾病是一組生化指標經(jīng)過系統(tǒng)分析后的偏離常態(tài),單靠傳統(tǒng)的、孤立、片面的幾個臨床指標已不能準確、全面、整體地反映疾病內(nèi)在變化和滿足對疾病診治的要求。利用不同性質(zhì)代謝物之間的相互偶聯(lián)關(guān)系和與生理、病理狀態(tài)的聯(lián)系對有效區(qū)分生理、病理狀態(tài),徹底闡述疾病的機理,合理利用藥物通過代謝干預(yù)達到診治疾病的目的都具有十分重要的意義。肝氣郁結(jié)證本質(zhì)研究,一直是中西醫(yī)結(jié)合研究領(lǐng)域的熱點之一。數(shù)十年來,對設(shè)想可能成為肝氣郁結(jié)證本質(zhì)的許多物質(zhì)如激素、cAMP、cGMP、神經(jīng)遞質(zhì)、微量元素等進行了大量研究,僅觀察到與肝氣郁結(jié)證本質(zhì)有關(guān)的現(xiàn)象和事實,但未能明確闡釋肝氣郁結(jié)證的實質(zhì)。目前,在研究中仍然存在著選取的一般指標項目較多,而特異性、敏感性均高的指標相對較少的現(xiàn)狀,其中不少指標在不同證型之間有類似的改變,因而臨床無鑒別價值。代謝組學是近年迅速發(fā)展起來的新興生命學科,它從代謝的角度研究生命的本質(zhì)及疾病的發(fā)生、發(fā)展過程。它把人體作為一個完整的系統(tǒng)來研究,研究人體代謝網(wǎng)絡(luò)在疾病和藥物作用下的變化規(guī)律,與中醫(yī)中藥整體觀點的哲學思想十分吻合