葡萄汁中可同化氮素對(duì)葡萄酒發(fā)酵的影響

葡萄汁中可同化氮素對(duì)葡萄酒發(fā)酵的影響

0葡萄汁可同化氮素的添加量葡萄酒的味道成分是葡萄酒質(zhì)量的重要組成部分。根據(jù)工藝過程和來源，葡萄酒香、發(fā)酵香和陳戈香分為品種香、發(fā)酵香和香料。發(fā)酵香氣是在葡萄酒酒精發(fā)酵過程中產(chǎn)生的香氣,主要構(gòu)成物質(zhì)為高級(jí)醇、酯類、揮發(fā)性脂肪酸、羰基化合物及揮發(fā)性硫化合物等。影響葡萄酒發(fā)酵香氣最基本的因素是發(fā)酵原料、酵母種類和發(fā)酵條件。葡萄汁中的氮化物影響酵母的生長(zhǎng)、發(fā)酵速率、發(fā)酵持續(xù)時(shí)間及糖代謝速率等。在酒精發(fā)酵過程中,酵母優(yōu)先利用的氮源為銨態(tài)氮、游離α-氨基酸(脯氨酸除外)和小分子多肽,被稱為酵母可同化氮素(yeast-assimilablenitrogen,YAN)。銨態(tài)氮是酵母可同化氮素的主要成分,是釀酒酵母優(yōu)先利用的無機(jī)氮源;而葡萄汁中的游離氨基酸是葡萄酒發(fā)酵香氣成分的主要前體物,其含量直接影響葡萄酒中高級(jí)醇、酯類及揮發(fā)性脂肪酸等香氣成分的形成。葡萄汁可同化氮素的組成及含量與品種、砧木、生態(tài)條件、施肥、土壤管理、果實(shí)成熟度等密切相關(guān)[12,16,17,18,19,20,21]。較多的研究認(rèn)為,葡萄酒正常發(fā)酵所需的最低可同化氮素含量為140—150mgN·L-1,適宜發(fā)酵需要的可同化氮素為200—500mgN·L-1,超過500mgN·L-1則認(rèn)為可同化氮素含量過量。實(shí)際上,發(fā)酵所需的可同化氮素濃度與酵母菌株、葡萄汁含糖量、發(fā)酵條件等密切相關(guān)。葡萄汁中可同化氮素含量過低(小于140mgN·L-1)會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵過程中酵母菌數(shù)量低,發(fā)酵活力弱,增加葡萄酒發(fā)酵延緩和中止的危險(xiǎn)性;生產(chǎn)上為了避免和解決這一問題,通常在發(fā)酵前和發(fā)酵早期向葡萄汁中添加可同化氮素如銨鹽、氨基酸等;但可同化氮素添加過量會(huì)導(dǎo)致生物胺和致癌物質(zhì)氨基甲酸乙酯的產(chǎn)生。國(guó)外關(guān)于葡萄汁可同化氮素的添加對(duì)酒精發(fā)酵動(dòng)力學(xué)、葡萄酒香氣成分及葡萄酒的質(zhì)量等方面進(jìn)行了很多研究[12,13,14,15,16,17,24,25,26,27,28,29,30],如Vilanova等與Torrea等研究認(rèn)為,高級(jí)醇、支鏈脂肪酸、支鏈脂肪酸乙酯含量隨葡萄汁中可同化氮素含量增加而減少,而中鏈脂肪酸和中鏈脂肪酸酯隨可同化氮素含量增加而增加。目前國(guó)內(nèi)有關(guān)可同化氮素與酵母生長(zhǎng)、發(fā)酵動(dòng)力和發(fā)酵香氣物質(zhì)的研究很少,張瑾等研究表明,模擬葡萄汁中可同化氮素含量增加,酵母菌數(shù)量增加,發(fā)酵速率加快,高級(jí)醇和酯類含量升高。因此,葡萄汁中可同化氮素的含量及葡萄酒釀造過程中可同化氮素的合理添加,對(duì)于提高葡萄酒發(fā)酵過程中優(yōu)良香氣物質(zhì)的產(chǎn)生,減少不良香氣,進(jìn)一步提高葡萄酒的感官質(zhì)量具有重要的意義。作者在本課題組研究釀酒葡萄果實(shí)氮化物的基礎(chǔ)上,結(jié)合前人研究成果,綜述了葡萄汁可同化氮素對(duì)葡萄酒發(fā)酵香氣物質(zhì)的影響。1酒精發(fā)酵過程高級(jí)醇、酯類、揮發(fā)性脂肪酸及揮發(fā)性硫化合物是葡萄酒發(fā)酵香氣的重要組成成分。高級(jí)醇主要是由酵母菌酒精發(fā)酵過程中氨基酸和糖代謝中間產(chǎn)物α-酮酸形成;酯類物質(zhì)包括脂肪酸乙酯和乙酸酯,分別由?；鵆oA與乙醇和高級(jí)醇合成;揮發(fā)性脂肪酸是高級(jí)脂肪酸裂解或醇、醛氧化的產(chǎn)物;揮發(fā)性硫化合物主要是半胱氨酸和甲硫氨酸代謝過程的產(chǎn)物;發(fā)酵香氣物質(zhì)的合成途徑見圖1。1.1高級(jí)醇及氨基類化合物所有酵母發(fā)酵過程中都會(huì)產(chǎn)生一定量的高級(jí)醇,目前已從葡萄酒中檢測(cè)到100余種高級(jí)醇類物質(zhì)。除乙醇外,高級(jí)醇約占葡萄酒香氣成分的50%,對(duì)葡萄酒香氣有重要影響,其含量低于300mg·L-1時(shí),可增加葡萄酒香氣的復(fù)雜性,但其含量超過300mg·L-1時(shí),則會(huì)破壞葡萄酒的香氣。發(fā)酵過程中形成的高級(jí)醇主要有1-丙醇(清爽,酒精味)、1-丁醇(酒精味)、2-甲基-1-丙醇(苦杏仁味)、2-甲基-1-丁醇(藥物化學(xué)味)、3-甲基-1-丁醇(奶酪味)、異丁醇(雜醇油的醇香)、異戊醇(苦杏仁味、澀味)、1-己醇(青菜味、吐司味)、苯甲醇(苦杏仁味)和2-苯乙醇(玫瑰花香、薔薇香氣、花粉味)等。大多數(shù)高級(jí)醇是酵母發(fā)酵的副產(chǎn)物,由氨基酸衍生的α-酮酸形成,或由葡萄糖代謝過程中間產(chǎn)物α-酮酸形成,如圖2所示?？赏睾枯^低會(huì)導(dǎo)致酵母菌發(fā)酵活力減弱,使葡萄糖代謝中間產(chǎn)物α-酮酸過剩,大量酮酸脫羧還原形成高級(jí)醇;反之,可同化氮素含量高會(huì)減少高級(jí)醇產(chǎn)生。許多研究表明,高級(jí)醇含量與起始可同化氮素含量成反比,尤其是在低氮含量下。Torrea等發(fā)現(xiàn)向霞多麗葡萄汁中添加銨和氨基酸,當(dāng)可同化氮素含量在200—500mgN·L-1時(shí),2-甲基-1-丙醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、1-己醇和2-苯乙醇等所有高級(jí)醇隨可同化氮素含量增加而減少;當(dāng)可同化氮素含量低于300mgN·L-1時(shí),高級(jí)醇含量高于300mg·L-1,破壞了葡萄酒的香氣。同時(shí)Losada等及Hernández-orte等研究發(fā)現(xiàn)向葡萄汁中添加銨鹽或氨基酸,異戊醇和苯甲醇等含量隨可同化氮素濃度增加而顯著減少。因此,添加銨或氨基酸使葡萄汁可同化氮素含量增加,高級(jí)醇含量減少,雜醇油等不愉快氣味減少,可提高葡萄酒的香氣質(zhì)量。但是也有研究表明,葡萄汁中添加支鏈氨基酸亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸反而會(huì)增加異戊醇、異丁醇和苯乙醇的含量。Lilly等發(fā)現(xiàn)向葡萄汁中添加纈氨酸可增加葡萄酒異丁醇的含量,添加亮氨酸和異亮氨酸可增加異戊醇含量,其中添加亮氨酸還可間接增加2-苯乙醇含量。Hernández-orte等研究發(fā)現(xiàn),苯丙氨酸含量與2-苯乙醇產(chǎn)生量成正比關(guān)系,葡萄汁中苯丙氨酸含量增加,2-苯乙醇含量會(huì)顯著增加。1.2其他葡萄汁添加的化學(xué)成分葡萄酒中含有有機(jī)酸和醇類,有機(jī)酸和醇可以發(fā)生酯化反應(yīng),生成各種酯類化合物,發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酯類主要有脂肪酸乙酯和乙酸酯,在酯酶催化作用下?；鵆oA與乙醇合成形成脂肪酸乙酯,乙酰CoA與高級(jí)醇合成乙酸酯,它們能賦予葡萄酒果香和花香,對(duì)葡萄酒香氣質(zhì)量有重要貢獻(xiàn)。發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酯類主要有:乙酸乙酯(果香、酯香)、丁酸乙酯(酸果香、草莓香)、己酸乙酯(青蘋果味、草莓香、茴香味)、辛酸乙酯(果香、茴香味)、葵酸乙酯(脂肪味、果香、舒適的醋味)、乙酸己酯(梨味)、乙酸異戊酯(香蕉味)、乙酸-2-苯乙酯(舒適的花香);此外還有一些支鏈脂肪酸乙酯,如異丁酸乙酯(果香、草莓味)和異戊酸乙酯(香蕉味、甜果香)等。葡萄酒中,中鏈脂肪酸乙酯和乙酸酯含量一般隨葡萄汁中可同化氮素含量的增加而增加,而支鏈脂肪酸乙酯含量隨可同化氮素含量增加而減少。Mendes-Ferreira等向可同化氮素含量缺乏的葡萄汁中添加磷酸氫二銨使可同化氮素含量達(dá)到200—500mgN·L-1,發(fā)現(xiàn)葡萄酒中丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和葵酸乙酯等中鏈脂肪酸乙酯以及乙酸異戊酯、乙酸-2-苯乙酯等乙酸酯含量隨可同化氮素增加而顯著增高,但丁二酸二乙酯、異丁酸乙酯、異戊酸乙酯和2-甲基己酸乙酯等支鏈脂肪酸乙酯含量隨可同化氮素含量增加而減少。Garde-Cerdan和AncínAzpilicueta研究發(fā)現(xiàn),向Mazuelo葡萄汁中添加45—250mgN·L-1可同化氮素,發(fā)現(xiàn)酯類總含量、乙酸異戊酯和乙酸-2-苯乙酯等乙酸酯含量與添加的可同化氮素含量成正比關(guān)系;而丁二酸二乙酯和3-羥基丁酸乙酯等支鏈脂肪酸乙酯含量則與添加的可同化氮素含量成反比關(guān)系。因此,隨葡萄汁可同化氮素含量在140—500mgN·L-1內(nèi)增加,丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和葵酸乙酯等中鏈脂肪酸乙酯及乙酸酯含量增加,葡萄酒的果香和花香增加。1.3添加量對(duì)葡萄酒脂肪酸含量的影響揮發(fā)性脂肪酸是高級(jí)脂肪酸裂解或醇、醛氧化的產(chǎn)物,葡萄酒中常見的揮發(fā)性脂肪酸有乙酸(醋味)、丙酸(羊腥味)、丁酸(變質(zhì)奶酪味)、異丁酸(脂肪味)、戊酸(不愉快化學(xué)味)、異戊酸(腐敗味)、己酸(貓尿味、汗臭味)、辛酸(奶酪味、腐敗味、澀味)和葵酸(不愉快脂肪味)等。雖然丁酸、己酸、辛酸和葵酸具有不愉快氣味,但它們形成的乙酯,與品種香氣協(xié)調(diào)性良好,是葡萄酒香氣質(zhì)量的重要保證。許多研究表明,在可同化氮素低于150mgN·L-1的葡萄汁中添加磷酸氫二銨、硫酸銨或氨基酸至同化氮素含量在200—500mgN·L-1時(shí),隨著可同化氮素添加量的增加,2-甲基丙酸、2-甲基丁酸和3-甲基丁酸、異丁酸和異戊酸等支鏈酸含量隨可同化氮素含量的增加而減少,而己酸、辛酸和葵酸等中鏈脂肪酸隨可同化氮素含量增加而增加。說明葡萄汁中等或較高含量的可同化氮素含量使葡萄酒2-甲基丙酸、2-甲基丁酸、3-甲基丁酸、異丁酸和異戊酸等支鏈酸含量減少,腐敗味及不愉快脂肪味減少,香氣質(zhì)量提高;同時(shí)己酸、辛酸和葵酸等中鏈脂肪酸含量增加,會(huì)促進(jìn)相應(yīng)的乙酯形成,增加葡萄酒的果香和花香。乙酸是葡萄酒中含量最高的脂肪酸,國(guó)標(biāo)規(guī)定其含量不能超過1.2g·L-1。葡萄汁可同化氮素含量中等時(shí),乙酸產(chǎn)生量低,但含量過高,會(huì)導(dǎo)致乙酸含量增加,破壞香氣質(zhì)量。目前乙酸形成機(jī)理與可同化氮素之間關(guān)系研究的最透徹,Bely等發(fā)現(xiàn)可同化氮素對(duì)葡萄酒乙酸產(chǎn)生影響的原因是可同化氮素影響酵母的生長(zhǎng)速率和細(xì)胞數(shù)量,酵母數(shù)量變化影響細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓,為了維持滲透壓,需要產(chǎn)生NADH,抑制了乙醛還原為乙醇,而促進(jìn)了乙醛氧化為乙酸。Barbosa等研究表明,在葡萄汁可同化氮素含量低于400mgN·L-1時(shí),葡萄酒的乙酸含量較低,而可同化氮素含量高于400mgN·L-1時(shí),乙酸含量明顯增高。Vilanova等發(fā)現(xiàn)葡萄汁中可同化氮含量為200—300mgN·L-1時(shí),乙酸含量較低,為0.3—0.4g·L-1,而可同化氮素含量為500mgN·L-1時(shí),乙酸產(chǎn)生量最高,為1.2g·L-1。因此,葡萄汁中可同化氮素含量過高時(shí),可能會(huì)導(dǎo)致乙酸含量超標(biāo),影響葡萄酒的質(zhì)量。1.4葡萄汁添加量隨添加氮素的變化葡萄酒中揮發(fā)性硫化合物分為兩類:高揮發(fā)性硫化合物(沸點(diǎn)<90℃)和低揮發(fā)性硫化合物(沸點(diǎn)>90℃),高揮發(fā)性硫化合物主要為H2S、乙硫醇和甲硫醇等,這些高揮發(fā)性硫化合物不易清除,且在低濃度下也具有不良香氣,對(duì)葡萄酒品質(zhì)有極大危害。H2S具有不愉快的“臭雞蛋”味,主要由酵母中無機(jī)硫化合物、硫酸鹽、亞硫酸鹽或有機(jī)硫化合物半胱氨酸、谷胱甘肽代謝產(chǎn)生。如圖3所示,當(dāng)葡萄汁中缺乏有機(jī)硫化合物,酵母主要利用無機(jī)硫化合物合成有機(jī)硫化合物,H2S是代謝中間產(chǎn)物,這一過程需要適宜的氮供應(yīng),如果可同化氮素供應(yīng)不足,游離H2S在酵母細(xì)胞中累積,然后擴(kuò)散到發(fā)酵的葡萄汁中。Marks等研究發(fā)現(xiàn),可同化氮素是調(diào)控酒精發(fā)酵階段H2S產(chǎn)生的重要因素。Ugliano等向可同化氮素低于140mgN·L-1的霞多麗葡萄汁中添加銨鹽至可同化氮素含量為200—500mgN·L-1時(shí),H2S含量隨可同化氮素含量增加而減少。其它高揮發(fā)性硫醇如甲硫醇和乙硫醇,分別賦予葡萄酒臭雞蛋和洋蔥味,其含量同樣隨葡萄汁可同化氮素含量增加而降低。Hernández-orte等研究發(fā)現(xiàn)甲硫醇含量隨葡萄汁中可同化氮素含量增加而減少,可同化氮素含量為100mgN·L-1產(chǎn)生的甲硫醇含量是可同化氮素含量為300mgN·L-1時(shí)的3倍。因此,葡萄汁可同化氮素含量低于140mgN·L-1時(shí),高揮發(fā)性硫化合物含量多,使葡萄酒具有令人不愉快的臭味;隨著可同化氮素在200—500mgN·L-1增加,高揮發(fā)性硫化合物含量降低,葡萄酒香氣質(zhì)量提高。另有研究發(fā)現(xiàn),葡萄汁可同化氮素對(duì)H2S的影響受酵母菌株、泛酸和生物素等因素的影響。Mendes-Ferreira等發(fā)現(xiàn)對(duì)釀酒菌株UCD522和PYCC4072而言,H2S含量隨葡萄汁可同化氮素含量增加而減少。Wang等發(fā)現(xiàn)當(dāng)葡萄汁泛酸含量缺少時(shí),可同化氮素含量增加,H2S產(chǎn)生量反而增加,而當(dāng)泛酸含量充足時(shí),可同化氮素含量增加,H2S含量下降。Bohlscheid等發(fā)現(xiàn)生物素含量過低和過高時(shí),可同化氮素含量增加,H2S含量會(huì)有所增加。2藥物組分對(duì)葡萄酒感官評(píng)價(jià)的影響在酒精發(fā)酵過程中,糖代謝產(chǎn)生多種揮發(fā)性成分,包括高級(jí)醇、脂肪酸、酯類、羰基化合物、硫化物和有機(jī)酸等,構(gòu)成葡萄酒香氣和滋味成分?？赏貙?duì)這些化合物的形成有重要的貢獻(xiàn),尤其是高級(jí)醇和酯類;另外,也影響其它揮發(fā)性成分如H2S、硫醇和揮發(fā)性脂肪酸的形成。因此,可同化氮素的組成和含量對(duì)葡萄酒的成分及感官質(zhì)量有重要的影響。通常認(rèn)為含有高含量酯類和低含量高級(jí)醇的葡萄酒具有較高的感官評(píng)價(jià),葡萄汁可同化氮素含量影響高級(jí)醇和酯類的產(chǎn)生,從而影響其葡萄酒感官評(píng)價(jià)。當(dāng)葡萄汁可同化氮素為低氮水平時(shí),發(fā)酵過程中高級(jí)醇產(chǎn)生量較高而酯類產(chǎn)生量較少,感官質(zhì)量差;而葡萄汁可同化氮素為中等水平或高水平時(shí),發(fā)酵過程產(chǎn)生的高級(jí)醇含量減少,而具有果香和花香的酯類含量增高,感官質(zhì)量較高。Hernández-orte等發(fā)現(xiàn)發(fā)酵前向葡萄汁中添加可同化氮素能改善葡萄酒的感官質(zhì)量,使不良?xì)馕度缌蛭逗瓦€原味減少,而花香和植物香增加。Torrea等發(fā)現(xiàn)可同化氮素含量低的葡萄汁釀造的葡萄酒果香和花香產(chǎn)生量低;中等可同化氮素水平釀造的葡萄酒其優(yōu)良香氣和不良香氣達(dá)到平衡,香氣質(zhì)量好;而高可同化氮素水平釀造的葡萄酒能產(chǎn)生果香和花香,同時(shí)也產(chǎn)生酸味和溶劑味,降低了葡萄酒整體感官質(zhì)量。3葡萄汁促進(jìn)酯化反應(yīng)的基因表達(dá)目前,酒精發(fā)酵過程中與釀酒酵母氮代謝有關(guān)的基因主要有GAP1(氨基酸通透酶表達(dá)基因)、MEP2(銨通透酶表達(dá)基因)、CAN1(精氨酸通透酶表達(dá)基因)、GAD1(谷氨酸代謝)、GDH1(谷氨酸脫氫酶表達(dá)基因)、BAT1和BAT2(側(cè)鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶表達(dá)基因)、ATF1和ATF2(醇?；D(zhuǎn)移酶表達(dá)基因)以及ALD基因(醛脫氫酶表達(dá)基因)。其中BAT、ATF、ALD基因直接參與酒精發(fā)酵過程中發(fā)酵香氣物質(zhì)的產(chǎn)生,BAT直接參與高級(jí)醇的形成,ATF調(diào)控乙酯產(chǎn)生,ALD參與揮發(fā)性脂肪酸的形成,它們都與葡萄汁可同化氮素含量有顯著的關(guān)系。BAT1和BAT2基因調(diào)控側(cè)鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶催化氨基酸轉(zhuǎn)變成高級(jí)醇生物合成的前體物質(zhì)α-酮酸,從而影響高級(jí)醇的含量。Yoshimoto等研究發(fā)現(xiàn)氨基酸生物合成基因(BAT1、BAT2)在低可同化氮素水平下表達(dá)增加,而在高可同化氮素水平下表達(dá)受抑制。Lilly等研究表明BAT基因表達(dá)量增加使葡萄酒異戊醇、異丁醇含量升高,乙酸、辛酸和葵酸等中鏈脂肪酸的形成與BAT1和BAT2的表達(dá)沒有顯著的關(guān)系,而BAT基因的過量表達(dá)能減少乙偶胭(異丁醇和異戊醇前體物質(zhì))和乙酸乙酯的含量。ATF1和ATF2基因調(diào)控醇?；D(zhuǎn)移酶促進(jìn)乙酯生物合成。Yoshimoto等研究發(fā)現(xiàn)增加可同化氮素利用率能提高ATF1和ATF2基因的表達(dá)水平,促進(jìn)乙酯的形成。Laere等發(fā)現(xiàn)ATF基因表達(dá)量增加能提高乙酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和葵酸乙酯等酯類的產(chǎn)生。ALD4、ALD5基因編碼線粒體醛脫氫酶,ALD2、ALD3和ALD6基因編碼細(xì)胞質(zhì)醛脫氫酶,ALD4和ALD6能調(diào)控乙醛合成乙酸。Marks發(fā)現(xiàn)向雷司令葡萄汁中添加可同化氮素能抑制ALD2、ALD4和ALD5基因的表達(dá),但不影響ALD6基因表達(dá),ALD4基因表達(dá)受抑制會(huì)減少乙酸的含量?？梢?葡萄汁可同化氮素水平與釀酒酵母氮代謝相關(guān)基因的表達(dá)及發(fā)酵香氣成分具有密切的關(guān)系。因此,進(jìn)一步深入研究酒精發(fā)酵