巴特火麻仁木脂素酰胺類粗提物的分離鑒定及活性清除作用研究

巴特火麻仁木脂素酰胺類粗提物的分離鑒定及活性清除作用研究

生物能量代謝將氧氣作為氧氣代謝過程中的電子接受體，不可避免地產(chǎn)生氧自由基（ros）。根據(jù)相關(guān)研究，自由基氧化損傷與衰老、疾病和人類免疫缺陷（hiv）感染之間存在著密切的關(guān)系[1.3]。因此，自由基分離劑逐漸成為研究的熱點。巴馬火麻仁源自于世界著名第五大長壽之鄉(xiāng)——廣西巴馬,為?？浦参锎舐镃annabissativaL.的干燥成熟果實.目前,對火麻仁藥理作用的研究主要是火麻仁油的抗氧化活性,而對其木脂素酰胺類(lignanamidesofFructusCannabis,LFC)的藥理活性研究較少,其抗氧化活性的相關(guān)研究在國內(nèi)外均未見報道,因此本文通過研究LFC體外清除自由基活性,以期篩選能阻斷氧自由基反應的天然、高效的抗氧化活性物質(zhì),為火麻仁進一步的開發(fā)利用提供可靠的科學依據(jù).1實驗部分1.1桑科植物治療水生動物的研究AL204電子微量分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);Cary50紫外可見分光光度計(美國瓦里安中國有限公司);火麻仁(廣西省巴馬縣,為當年收獲,經(jīng)中國人民解放軍第302醫(yī)院中醫(yī)藥研究所肖小河研究員鑒定為?？浦参锎舐镃annabissativaL.的干燥成熟果實);抗超氧陰離子自由基試劑盒、抗羥自由基試劑盒(批號20080624,南京建成生物工程研究所);D101大孔樹脂(河北滄州寶恩化工有限公司);柱層析用硅膠(200~300目,青島市海洋試劑廠);DPPH(美國Sigma公司);其余試劑均為分析純.1.2乙酸乙酯萃取物上柱層析將粉碎的火麻仁粉末10kg,用10倍70%的乙醇溶劑提取2次,每次1.5h,減壓濃縮,用乙酸乙酯萃取所得的乙酸乙酯萃取物上柱層析用硅膠(200~300目)以氯仿-甲醇(85∶15)洗脫,并用SephadexLH20純化后反復用甲醇重結(jié)晶,得白色粉末.1.3粗提物的提取火麻仁粉碎后經(jīng)石油醚脫脂,用8倍70%的乙醇溶劑提取2次,每次1.5h,抽濾,得到粗提物.將濾液減壓回收至密度為1.05~1.10,采用低醇上樣,上D101大孔樹脂,用60%的乙醇洗脫得到精提物(純度57.95%).1.4總木脂素酰胺含量測定以cannabisinA為對照品(歸一化法測定其含量為98.3%),用改進的Folin-酚法測總木脂素酰胺的含量.1.5對dpph的清除作用精密稱取20mgDPPH·,用無水乙醇溶解并定容于250mL量瓶中,DPPH·的濃度為20mmol/L,冰箱避光保存.按表1加樣于具塞試管中,充分混勻,室溫靜置30min,以無水乙醇做空白,在517nm波長處測定其吸光度.根據(jù)下列公式計算測定液對DPPH·的清除率(P):P=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%.1.6o-pla-1,2-o--pla采用超氧陰離子自由基測試盒,模擬人體黃嘌呤與黃嘌呤氧化酶反應體系,產(chǎn)生超氧陰離子自由基(O2-).反應如下:按照測試盒說明進行加樣,充分混勻,于37℃恒溫水浴40min,加入2mL顯色劑,混勻后靜置10min,用蒸餾水調(diào)零,測定550nm波長處的吸光度A550.待測液對2O-的抑制率=(對照管A550-測定管A550)/對照管A550×100%.1.7抑制率測定采用羥自由基試劑盒,以經(jīng)典的Fenton反應體系產(chǎn)生OH·,反應如下:按照測試盒說明進行加樣,混勻后于37℃反應l.0min.再分別加入2mL顯色劑,室溫放置20min,用蒸餾水調(diào)零,測定550nm波長處的吸光度A550.待測液對OH·的抑制率=(對照管A550-測定管A550)/對照管A550×100%.1.8處理數(shù)據(jù)實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差示結(jié)果,采用Origin7.5的曲線擬合工具計算樣品清除自由基的半數(shù)有效劑量值EC50.2結(jié)果與討論2.1離子檢測FAB-MS(m/z):595[M+H]+,表明分子量為594,主要碎片離子峰為458.2,186.2.該化合物1HNMR(DMSO,500MHz)和13CNMR(DMSO,125MHz)數(shù)據(jù)與文獻中的數(shù)據(jù)基本一致,故鑒定該化合物為cannabisinA.2.2dpph的清除活性由于DPPH·苯環(huán)的共軛和位阻及硝基的吸電子作用使夾在中間的氮原子上的不成對電子不能發(fā)揮電子成對作用,因此DPPH·是一種穩(wěn)定的自由基.在無水乙醇溶液呈深紫色,且在517nm處有一強吸收峰.當自由基清除劑存在時,DPPH·與其給出的氫相結(jié)合,反應體系的顏色不斷變淺,其褪色程度與接受的電子數(shù)成定量關(guān)系.粗提物、精提物及cannabisinA對DPPH·的清除能力見圖2及表2.由圖可知,三者均具有明顯的清除DPPH·的活性并與劑量呈一定的量效關(guān)系,精提物、cannabisinA清除DPPH·的活性略高于粗提物.在7.61~12.9μg/mL范圍內(nèi)三者清除DPPH·的速率增長得最快;當濃度達到22.7μg/mL時,粗提物、精提物及cannabisinA對DPPH·的清除率達到最大值,分別為74.77%,90.31%,85.77%.2.3o2-的清除能力O2-是生物體內(nèi)最早生成的一種自由基,能反應生成其它自由基,如H2O2,OH·等.粗提物、精提物及cannabisinA對O2-的清除能力見圖3及表2.可知,在所選劑量范圍內(nèi),三者具有一定的清除O2-的活性并與劑量呈明顯的量效關(guān)系.CannabisinA對O2-的清除活性明顯低于粗提物、精提物,而粗提物清除O2-的活性略低于精提物.CannabisinA在劑量為0.69mg/mL時清除率達到最大值85.79%,而粗提物、精提物在0.46mg/mL就分別達到86.79%,91.10%.2.4粗提物、精提物及cannabisina的體外抗氧化活性評價生物體內(nèi)的O2-在超氧化物歧化酶(SOD)的作用下還原生成H2O2,H2O2再與O2-作用進一步通過Haber-Weiss反應生成OH·.OH·是目前所知活性最強、對生物體內(nèi)毒性最大的一種自由基,因此清除OH·的活性成為評價抗氧化活性的重要指標.由圖4可知,在所選劑量范圍內(nèi),三者具有明顯清除OH·的活性并與劑量呈量效關(guān)系,但精提物及cannabisinA清除OH·的活性遠遠高于粗提物,粗提物、精提物及cannabisinA的EC50分別為105.1,8.424,16.80μg/mL(表2),精提物及cannabisinA清除OH·的活性幾乎分別是粗提物的13倍、6.5倍.O2-及OH·是生物體內(nèi)最重要的兩種氧自由基,它們對體內(nèi)生物大分子的攻擊,往往可引起其他重要自由基的生成(如脂過氧自由基ROO·).LFC屬于多酚類物質(zhì)(Polyphenols),由于其苯環(huán)上酚羥基的供氫作用,將H·供給R·,OH·等活性自由基,自身在鄰位羥基或甲氧基的影響下能形成相對穩(wěn)定的酚氧自由基A·,可以終止自由基的鏈鎖反應,因此具有一定的抗氧化作用,其活性大小主要取決于酚羥基的數(shù)目與位置.反應機理如下:本文對粗提物、精提物及cannabisinA進行了體外清除DPPH·,O2-及OH·的活性評價,發(fā)現(xiàn)精提物對以上三種自由基的清除能力最強,表明LFC可能是火麻仁的主要活性成分,經(jīng)大孔樹脂富集后純度更高;而cannabisinA活性清除作用之所以低于精提物,可能是精提物中共存的木脂素酰胺類成分產(chǎn)生了協(xié)同效應從而增強了抗氧化活性;與粗提物的清除活性相比,cannabisinA清除DPPH·,OH·的活性較強,而清除O2-的活性較弱,其原因有待于進一