第八章 動物基因工程

第八章

動物基因工程動物基因工程是利用DNA重組技術對動物所進行的工程操作。從遺傳學角度分為：遺傳性動物基因工程：外源基因能夠通過配子進行垂直傳遞并穩(wěn)定的遺傳。非遺傳性動物基因工程：轉基因僅在當代表現(xiàn)，不能夠遺傳給子代。第一節(jié)動物基因工程的發(fā)展狀況與趨勢

動物基因工程的實質是改變動物的遺傳組成，增加動物的遺傳多樣性，賦予轉基因動物新的表型特征，使能夠更好地服務與人類社會。世界首只轉基因靈長類動物

——-安迪世界第一只轉基因動物熒光魚轉基因兔轉基因兔鼠據英國媒體4日報道，英國第四頻道電視臺將在一個新的電視節(jié)目秀中披露一個轉基因動物農場中的眾多驚人內幕：在那個農場中，綿羊長著人心臟、山羊會吐蜘蛛絲、奶牛尺寸是普通牛的3倍大，而豬則會在黑暗中發(fā)光！據英國第四頻道電視主任凱文·利戈稱，他們拍攝下來的農場中的所有轉基因動物，全都真實存在，而非科幻電影中的虛構場景。轉基因細菌可治癌癥

英國醫(yī)學專家日前將轉基因大腸桿菌與一種抗癌藥相結合，成功殺死了實驗鼠體內的癌細胞?？茖W家將轉基因大腸桿菌注射到實驗鼠的腫瘤內，再給實驗鼠注射一種名叫6－MPDR的抗癌藥。這種藥無法單獨發(fā)揮作用，但是一種由轉基因大腸桿菌分泌的酶能將此藥物“激活”，形成一種有效的毒素，將其周圍的癌細胞殺死，而不傷害其它組織器官。

據路透社11月8日報道，日本科學家已經培育了一種新的基因改良老鼠，它們不具備感知危險氣味的能力，因此，對其死對手貓一點都不覺得害怕，相反還大膽地在貓身上爬來爬去，甚至偎依在貓身邊。此研究發(fā)表在7日出版的《自然》雜志上。文章的第一作者，東京大學的Takashi

Sakudoh說：“對蠶的色素傳輸系統(tǒng)的了解，使得我們有可能通過基因調控來控制蠶絲的顏色和色素比例?！?/p>

自然界中，蠶繭的顏色有白色、黃色、稻草色、橙紅色、粉紅色和綠色。絲綢的顏色來自于桑蠶吃桑樹葉時對自然色素的吸收。

從轉基因的技術手段來看，除DNA顯微注射法外，人們先后試過反轉錄病毒載體介導法、精子介導法、胚胎干細胞介導法和核移植法等多種轉基因方法。

轉基因細胞的核移植技術已經成為轉基因動物生產的主流方法。1、從簡單的顯微注射法向高效率的轉基因體細胞核移植方向發(fā)展轉基因在基因組中的存在方式有兩種，即隨機整合和定點整合。為了達到外源基因的高效表達，在轉基因結構上增加了含有位點控制區(qū)（LCR）、核基質附著區(qū)(MAR)等調控元件，可以實現(xiàn)插入位點非依賴性、拷貝數(shù)相關的表達模式。LCR和MAR的功能不受種屬差異的限制，無論外源基因插入什么位點，都能夠維持一個開放的染色體結構，有利于基因的表達?；虼虬屑夹g的出現(xiàn)與發(fā)展，實現(xiàn)了對目的基因的定位操作。2、從外源基因隨機插入(或整合)到定點整合的轉變

從轉基因的策略來看，動物轉基因技術的發(fā)展經歷了兩個階段：第一階段為傳統(tǒng)轉基因動物階段，第二階段為條件性轉基因動物階段。借助轉基因技術可將單一的功能基因和基因簇引入高等動物的基因組，或將目的基因從動物基因組中敲除，實現(xiàn)了種系內和種系間基因轉移或修飾，產生新的基因型和表型。目前轉基因動物主要應用在生物學基礎研究、醫(yī)學疾病模型、動物生物反應器、異種器官移植、動物遺傳改良等５個方面。３、從傳統(tǒng)轉基因到條件控制的轉變

第二節(jié)轉基因動物技術一、動物基因工程載體二、基因轉移技術一、動物基因工程載體作為動物基因工程載體必須具備以下幾個功能：

為外源基因提供進入受體細胞的轉移能力為外源基因提供在受體細胞內復制或整合的能力為外源基因提供在受體細胞內的擴增和表達能力載體可分為:質粒型表達載體病毒載體定向打靶載體1.質粒型表達載體表達載體的共同特點是都帶有原核復制區(qū)和選擇性標記基因，保證重組DNA分子能夠在大腸桿菌中擴增，同時也必須包括能在真核細胞表達的相關組件。一般包括轉錄外源DNA序列的啟動元件、轉錄產物有效地加上poly（A）尾巴所必需的信號序列、真核細胞中的選擇性標記，另外還增加了一些附加元件，如增強子、內含子、剪接供體與受點，以保證外源基因的高效表達。以山羊乳腺特性表達載體pBC1為例2.病毒載體作為基因轉移的病毒載體須具備以下基本條件：攜帶外源基因并能夠包裝成病毒顆粒介導外源基因的轉移與表達對機體不致?。?）腺病毒（adenovirus）

腺病毒作為轉染載體有許多特點：基因組的重排率低外源基因與病毒DNA重組后能遺傳幾個周期安全性好，不會整合到人的染色體上，不導致腫瘤的發(fā)生宿主范圍廣，對受體細胞是否處于分裂期要求不高外源基因在載體上容易高效表達（2）腺相關病毒（AAV）

腺相關病毒是一種天然復制缺陷型非致病性單鏈DNA病毒，其復制需要有輔助病毒的共轉染。無共轉染時，野生型AAV優(yōu)先（70%）整合在人染色體的19q13.3位點處，潛伏存在直至被輔助病毒拯救出來。其整合需要基因組兩端的ITR，以及非結構基因編碼的蛋白Rep78和Rep68的存在。

AAV具有以下幾個方面特點：非致病性、無免疫原性和無炎癥反應能感染靜止期的細胞，如神經元細胞插入的外源基因表達時間長，可達到1年之多宿主范圍廣熱穩(wěn)定性強，容易通過滅活輔助腺病毒純化（3）反轉錄病毒反轉錄病毒是一種整合型單鏈RNA病毒，感染宿主細胞后，病毒顆粒中的pol基因表達出反轉錄酶，以單鏈的RNA基因組為模板，立即轉錄出一份線形雙鏈DNA復本，然后在整合酶（Int）介導下，整合到宿主的基因組內，此時整和的病毒序列被稱為前病毒。反轉錄病毒基因組整合到宿主細胞基因組后，其DNA隨宿主DNA的復制而復制，并由5`-LTR中的一個強啟動子轉錄出病毒RNA鏈，它既是病毒基因組，同時又具有mRNA模板活性，翻譯出結構蛋白和反轉錄酶。在宿主細胞質中，兩條相同的RNA鏈和反轉錄酶被包裝與內殼中，形成的成熟病毒顆粒以芽植方式分泌至細胞外，但通常不致死宿主細胞。3.定向打靶載體基因打靶是通過外源基因與靶細胞染色體上的同源序列間的同源重組，將外源基因定點整合到靶細胞特定位置上，而使某一個特定位點上的基因發(fā)生定點突變的技術。在細胞內存在兩條相同的DNA鏈（同源染色體），在細胞內酶的作用下，可以將其切開，發(fā)生交叉，然后重新連接，從而發(fā)生DNA鏈的交換并引發(fā)重組。（1）基因敲除

敲除型載體由兩段與基因組內靶基因座序列同源的DNA片段（又稱同源臂）組成，中間為正向選擇標記，同緣臂外側為真核細胞中的負選擇標記及在原核細胞中進行復制與篩選的載體DNA序列。（2）基因敲入基因敲入是利用同源重組原理將外源基因插入到染色體的特定位點上?；蚯萌氲霓D基因結構設計上相似于基因敲除結構，但區(qū)別在于：或用外源基因替換并失活靶基因、或在不影響拔基因功能的前提下插入新的基因、或在染色體上特定位點插入新的外源基因，從而實現(xiàn)基因轉移，并使得外源基因高效表達（3）基因下調（knock-down）

RNA干擾（RNAi）又被稱為基因下調，通過干擾RNA（siRNA）分子的作用達到轉錄后基因沉默的效應。

siRNA的制備方法主要包括體外合成siRNA和siRNA表達載體兩種。體外合成的siRNA易轉染細胞，進入細胞后，可直接發(fā)揮作用，一般不存在siRNA表達載體的轉錄效率低及細胞毒性等問題。但是體外合成的siRNA只能瞬間干擾，不能達到長久抑制病毒的效果。

二、基因轉移技術物理轉染法化學轉染法生物法1.物理轉染法

（1）電擊法（electroporation）其基本原理是在外加電場的作用下，細胞膜電位發(fā)生改變，細胞質膜瞬間出現(xiàn)可逆性的電穿孔，從而使一定數(shù)量的外源DNA從細胞外擴散到細胞質和細胞核內，并進一步整合到宿主DNA上，達到轉基因目的。利用點穿孔法進行基因轉移（2）顯微注射法

將外源DNA在顯微鏡操作系統(tǒng)的輔助下，通過玻璃微管直接將外源DNA注入哺乳動物受精卵的原核內，使外源基因整合到基因組上，制備轉基因動物。（3）基因槍法

基本原理是將要轉染的DNA吸附到高黏度的金屬（鎢或金等）顆粒上，在一種加速裝置的作用下，將這些粒子高速打入細胞或組織內，達到轉基因目的（4）超聲波法（sonoporation）

超聲波增強基因轉染法的主要機制是聲波的空化效應導致細胞的通透性增高，而通過添加超生造影劑能降低空化域值，增強空化效應，促進外源基因進入細胞，提高基因的轉染效果2.化學轉染法（1）磷酸鈣法

將待轉染的DNA溶解在磷酸緩沖液中，加入CaCl2后，DNA片段與磷酸鈣共沉淀并形成大的顆粒；將此顆粒懸浮液加入貼壁培養(yǎng)的細胞中，外源DNA就被靶細胞所吸收，進而實現(xiàn)轉基因。

利用磷酸鈣共沉淀法進行DNA轉染質脂體介導的基因轉移（2）脂質體法（lipofection）將待轉染的DNA溶液與磷脂混合，后者在表面活性劑存在下形成包埋水相DNA的脂質體結構。當這種脂質體懸液加入到細胞培養(yǎng)液中，便會與受體細胞膜發(fā)生融合，DNA片段隨即進入細胞質或細胞核內。（3）原生質體融合法

含有目的基因的質粒轉化細菌或酵母細胞。大量擴增，利用溶菌酶或蝸牛酶去除胞壁部分，在高鹽條件下制成原生質體，然后散鋪在單層培養(yǎng)的哺乳動物細胞上，在融和劑（如聚乙二醇）作用下，使染色體或質粒轉如細胞內，實現(xiàn)轉基因

構建含有選擇性標記的反轉錄病毒基因組部分DNA與質粒的雜合型載體分子，在多克隆位點插入外源基因形成重組DNA分子，克隆到大腸桿菌中擴增鑒定；重組DNA分子通過物理或化學方法轉入一個特制的病毒包裝細胞系。轉染入包裝細胞系的重組DNA轉錄出相應的重組RNA分子，包裝細胞系分泌出來的重組反轉錄病毒，便可感染其他類型動物受體細胞，重組RNA分子以DNA形式整合到染色體上，并表達外源基因。3.病毒感染法

逆轉錄病毒載體穩(wěn)定、長期表達外源基因

原病毒DNA轉染進包裝細胞中，包裝原病毒產生將病毒RNA包裝成感染性病毒粒子的所有蛋白質，但卻不能包裝自身的RNA第三節(jié)轉基因動物制備轉基因動物的制備程序轉基因鑒定表達水平的檢測轉基因動物傳代與檢測一轉基因動物的制備程序DNA顯微注射法制備轉基因小鼠胚胎干細胞法制備轉基因小鼠轉基因體細胞核移植法生產轉基因牛1、DNA顯微注射法制備轉基因小鼠超數(shù)排卵

基因制備

胚胎移植顯微注射

轉基因個體的鑒定

顯微注射技術2、胚胎干細胞法制備轉基因小鼠

胚胎干細胞是從早期胚胎內細胞團中分離出的未分化、具有正常二倍體染色體和發(fā)育全能性的細胞。優(yōu)點：

可以在體外進行人工培養(yǎng)、長期擴增、冷凍保存胚胎干細胞制備轉基因動物過程（1）轉基因胚胎干細胞的獲得（2）囊胚注射（3）嵌合體的檢測和育種

胚胎干細胞基因轉化法(引自G1ick&Pasternak，1998)判斷是否是種系嵌合

首先用轉基因嵌合體的小鼠與正常的小鼠交配，對其后代進行檢測，如果后代中有轉基因個體出現(xiàn)，證明為種系嵌合，然后將轉基因雜合子個體進行橫交就會獲得轉基因純合子和雜合子個體。如果在后代中沒能發(fā)現(xiàn)轉基因純合子，應注意是否因為轉基因的純合造成了胚胎的早期死亡，無法得到成活個體所致。基因的準備供體細胞獲取傳代培養(yǎng)、擴增供體細胞的轉基因

轉基因供體細胞的篩選與擴增卵母細胞的獲得體外成熟培養(yǎng)卵母細胞的去核核移植重構胚體外培養(yǎng)胚胎移植獲得轉基因個體3、轉基因體細胞核移植法生產轉基因牛步驟一：從一只６歲芬蘭多塞特白面母綿羊（姑且稱為Ａ）的乳腺中取出乳腺細胞，將其放入低濃度的營養(yǎng)培養(yǎng)液中，細胞逐漸停止分裂，此細胞稱之為“供體細胞