心房鈉尿肽基因敲除小鼠的繁殖和鑒定

心房鈉尿肽基因敲除小鼠的繁殖和鑒定

作為一種遺傳因子藥物，氨基鈉尿（amp）是鈉尿（np）家族的第一個成員。它主要由心臟的肌肉細(xì)胞合成和釋放。鈉尿醇受體（epr）可通過結(jié)合心臟、血管、胃腸道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、淋巴組織、生殖器官和腎臟等組織或器官產(chǎn)生。促進(jìn)細(xì)胞環(huán)磷酸酯（cdmp）的生成，并產(chǎn)生有助于鈉胺和血管的利尿作用。最近研究發(fā)現(xiàn),ANP具有抗腫瘤血管生成及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用,但具體機(jī)制尚不清楚。由于基因工程小鼠具有能夠從動物整體水平上模擬相關(guān)基因在體內(nèi)的功能等諸多優(yōu)勢,因此本實驗室在前期研究的基礎(chǔ)上,從美國Jackson實驗室引進(jìn)了ANP基因敲除雜合子小鼠,并成功進(jìn)行了繁殖和鑒定,為進(jìn)一步研究ANP在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用和相關(guān)分子機(jī)制提供理想的動物模型。1材料和方法1.1細(xì)胞培養(yǎng)ANP基因敲除小鼠由美國Jackson實驗室引進(jìn)(StockNumber:002685),品系背景為C57BL/6J,雌雄各2只,基因型為雜合子(ANP+/-)。1.2飼養(yǎng)及飼養(yǎng)管理小鼠飼養(yǎng)于SPF環(huán)境中,室內(nèi)溫度控制在22～26℃,濕度50%～65%,光照控制12h明/12h暗,小鼠籠盒、墊料、飲用水均經(jīng)高溫高壓滅菌處理。飼料購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。飼養(yǎng)過程中,每天進(jìn)入動物房1次,觀察小鼠生長情況,準(zhǔn)時記錄小鼠受孕分娩時間。墊料每周更換2次并補(bǔ)充食物和水。小鼠的繁殖采用將性成熟的小鼠(6～8周齡)以雌雄按1∶1的比例同籠合養(yǎng)。雌性小鼠的妊娠期為19～21d,哺乳期為18～21d,留種小鼠可延長至23d,哺乳期滿的仔鼠要與母鼠分開,雌雄分籠飼養(yǎng)。配種小鼠定期給予滅菌葵花籽和蛋黃以補(bǔ)充營養(yǎng)。1.3子代的可能基因型由于引進(jìn)ANP敲除小鼠為雜合子,根據(jù)孟德爾定律,其子代可能基因型為雜合子(ANP+/-)、純合子(ANP-/-)及野生型(ANP+/+)。1.3.1小鼠細(xì)胞dna的提取剪取小鼠尾尖1～3mm,置于1.5mL離心管中,參照上海捷瑞生物工程有限公司細(xì)胞/組織DNA提取試劑盒說明提取小鼠DNA,加雙蒸水于4℃保存。1.3.2ctgctgatg基因敲除菌基因引物1:CCTTCTATCGCCTTCTTGACG位于替換的基因片段用于檢測突變型;引物2:CTGTCCAACACAGATCTGATG位于ANP基因敲除區(qū)域,用于檢測野生型;引物3:CTGTTGCAGCCTAGTCCACT作為通用引物。反應(yīng)條件為:94℃變性3min,94℃30s,61℃1min,72℃1min循環(huán)35次,72℃延伸2min。1.3.3引物擴(kuò)增產(chǎn)物分析取PCR產(chǎn)物5μL于1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析,引物1和引物3擴(kuò)增產(chǎn)物大小為700bp,為純合子小鼠;引物2和引物3擴(kuò)增產(chǎn)物大小為434bp,為野生型小鼠;2條電泳條帶均存在的為雜合子小鼠。2結(jié)果2.1生幼鼠的形態(tài)ANP基因敲除雜合子小鼠互交,成功獲得子代小鼠。新生幼鼠呈肉紅色,無毛,眼瞼未張開,尾短,四肢不發(fā)達(dá),活動能力有限;子代小鼠平均斷乳期為20d,生長發(fā)育情況對比C57BL/6小鼠無明顯異常。見圖1。2.2小鼠電泳條帶的生物量親代ANP基因敲除小鼠均為雜合子配種,子代小鼠有雜合、純合和野生型3種基因型。如圖2所示,1、2、3、5、6號小鼠電泳條帶位于700bp和434bp處為雜合子;7號小鼠電泳條帶位于700bp處為純合子;8號小鼠電泳條帶位于434bp處為野生型。2.3小鼠基因型鑒定結(jié)果6個月共繁育小鼠7代/次,得到子代小鼠88只,其中雄性52只,雌性36只。經(jīng)基因型鑒定,獲得ANP+/+小鼠31只,ANP+/-小鼠49只,ANP-/-小鼠8只;純合小鼠比例為9.09%,見表1。3anp基因敲除小鼠的臨床研究ANP是1981年deBold等在心房肌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)分泌激素,最初命名為心鈉素。后來經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)心鈉素是由肽類物質(zhì)構(gòu)成的,因此最終將其命名為ANP。ANP針對心血管、呼吸系統(tǒng)等疾病的研究比較常見,但ANP在腫瘤生長中的作用報道較少。最近研究發(fā)現(xiàn),ANP的受體NPRA在多種人類惡性腫瘤中高表達(dá),如肺癌、前列腺癌、卵巢癌、黑素瘤等,在一定程度上揭示了ANP對腫瘤的影響。有報道稱,ANP基因編碼合成的ANP前激素原(ANPprohormones,proANP),經(jīng)蛋白酶加工形成4種心臟激素:長效型利鈉肽(longactingnatriureticpeptide,LANP)、血管擴(kuò)張因子(vesseldilator,VDL)、利鉀尿肽(kaliureticpeptide,KP)以及ANP,這4種激素對多種腫瘤細(xì)胞有97%的抑制作用;在裸鼠實驗中,其對人類胰腺癌、乳腺癌和小細(xì)胞肺癌的抑制作用分別達(dá)到了80%、66%和86%。但該抗腫瘤作用在自發(fā)型小鼠疾病模型中的研究還未見報道。ANP基因敲除小鼠是由北卡來羅納大學(xué)的Dr.OliverSmithies于1995年構(gòu)建的,主要用于研究心血管疾病和食源性高血壓。該小鼠的主要表型為雜合子在低鹽飲食情況下血壓正常,高鹽飲食表現(xiàn)為高血壓;純合子小鼠則無論在低鹽或高鹽飲食下都表現(xiàn)為血壓異常升高。目前尚未見該品系小鼠在腫瘤研究中應(yīng)用的報道。純合子小鼠相對于雜合子小鼠能有更明顯的表型,因此本研究希望通過繁殖獲得大量ANP敲除純合子小鼠,以便下一步研究工作的展開。由于引進(jìn)的ANP基因敲除小鼠為雜合子,根據(jù)孟德爾遺傳定律,子代小鼠可能出現(xiàn)3種基因型,即ANP+/+、ANP+/-和AN