柴胡疏肝散對圍絕經(jīng)期綜合征肝郁證大鼠海馬區(qū)雌激素受體er,er,gpr

柴胡疏肝散對圍絕經(jīng)期綜合征肝郁證大鼠海馬區(qū)雌激素受體er,er,gpr

更年期綜合征是指更年期前后的卵巢功能萎縮，雌激素水平波動或降低，女性以獨立神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙為主，伴有神經(jīng)心理癥狀的癥狀群。中醫(yī)學稱之為“絕經(jīng)前后諸證”。近年來,許多研究發(fā)現(xiàn)圍絕經(jīng)期綜合征肝郁證女性的雌激素水平、雌激素受體以及肽類和單胺類神經(jīng)遞質的活性和含量都有明顯改變,動物實驗亦發(fā)現(xiàn)郁證動物海馬和下丘腦肽類和單胺類神經(jīng)遞質的變化與其相類似。傳統(tǒng)經(jīng)方柴胡疏肝散能改善圍絕經(jīng)期綜合征肝郁證的癥狀,本研究旨在以“以方測證”的方法研究圍絕經(jīng)期綜合征肝郁證發(fā)生的生物學機制,探討雌激素受體表達變化與大鼠海馬區(qū)神經(jīng)遞質釋放的關系。材料和方法1.實驗大鼠的分組及飼養(yǎng)條件選取雌性SD大鼠,SPF級[北京維通利華實驗動物中心提供,動物許可證號:SCXK(京)2006-2009],13月齡,48只,體質量370-380g;3月齡12只,體質量250-280g。13月齡組大鼠持續(xù)30d作陰道涂片,用95%酒精固定,5%堿性美藍溶液染色5min,吹干,鏡檢,呈現(xiàn)無持續(xù)動情5d以上大鼠作為圍絕經(jīng)期模型鼠,將其隨機分為對照組(B組)、對照加中藥組(C組),圍絕經(jīng)期綜合征肝郁證加中藥組(D組)、圍絕經(jīng)期綜合征肝郁證組(E組),每組12只。另選3月齡、有規(guī)則的動情周期、平均體質量達250-280g的雌性SD大鼠,共12只,作為育齡期空白對照組(A組),與其余各組相同條件飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件:分籠,每籠2只,于晝夜顛倒環(huán)境(每日21∶00開燈,9∶00關燈),除實驗期外自由飲食、飲水。所有實驗操作均在夜間、暗淡紅燈下進行。實驗過程中對動物處置符合中華人民共和國科學技術部頒布的實驗動物管理條例的規(guī)定。2.模型準備和評估2.1動情周期觀察、藥物干預和等體積、鈉圍絕經(jīng)期綜合征大鼠造模方法用自然衰老方法;肝郁證大鼠造模方法采用慢性束縛應激方法,采用曠場實驗檢測大鼠情緒、行為變化以判定造模是否成功,造模時間為3周。經(jīng)適應性飼養(yǎng)1周后,每日6h,束縛時間點隨機。同時進行動情周期觀察,選取連續(xù)5d不出現(xiàn)動情期的動物進行實驗,中藥干預組大鼠給予研究團隊前期研制的柴胡疏肝散(《景岳全書》原方原劑量組方:柴胡6g,白芍4.5g,枳殼4.5g,川芎4.5g,醋炒陳皮6g,香附4.5g,炙甘草1.5g)水溶液每日灌胃1次(每毫升藥液含原生藥1g,劑量1mL/100g體質量)。劑量均按臨床成人劑量的8倍計算,其余大鼠給予等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃。藥物干預3周后處死。2.2靜置-離心制備第22天時,所有大鼠空腹戊巴比妥(1mL/100g)麻醉,腹主動脈采血,將獲取的新鮮血液于4℃冰箱靜置6h后,以3000r/min室溫離心10min,取血清,標記后置-70℃低溫冰箱中備存;所有大鼠在冰上剝離大腦,迅速分離海馬,置冷凍管標記后,立即投入液氮中備用,以防止海馬組織內部RNA降解。3.試劑和設備3.1分離、n-n酶聯(lián)免疫試驗劑及檢測儀器海馬組織勻漿后3000r/min,4℃離心15min,取上清液,參照大鼠5-HT、β-END、NE酶聯(lián)免疫分析試劑盒(購自武漢華美公司)說明書進行,檢測儀器:EIX808U型全自動酶標儀(美國BioTekGC-2010型)。GeneAmpPCRSystem9700(AppliedBiosystems),引物設計軟件:Primer5.0]。3.2實際pcr反應用TRIZOL法抽提海馬組織總RNA,海馬組織總RNA的質量判斷使用紫外吸收測定法和變性瓊脂糖凝膠電泳法測定RNA濃度和純度。合成cDNA,將所有cDNA樣品分別配置Real-timePCR反應體系。體系:(1)2×MasterMix5μL、10μmol/L的PCR特異引物0.5μL加水至總體積為8μL,輕彈管底將溶液混合,5000rmin短暫離心。(2)加樣。a.將8μL混合液加到384-PCR板對應的每個孔中;b.再加入對應的2μLcDNA;c.小心粘上SealingFilm封口膜,并短暫離心混合;d.在設置PCR程序前將準備好的PCR板放在冰上。(3)將上述384-PCR板置于Real-timePCR儀上進行PCR反應。反應條件:95℃,10min;40個PCR循環(huán)[95℃,10s;60℃,60s(收集熒光)]。為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線,擴增反應結束后,按(95℃,10s;60℃,60s;95℃,15s);并從60℃緩慢加熱到99℃(儀器自動進行,RampRate為2%)。各樣品的目的基因和管家基因分別進行RealtimequantitativePCR反應,見表1。mRNA相對表達量以2-△△Ct表示,△Ct=(CtER-CtGAPDH);以A組作為基線,采用以下公式計算各組ERmRNA表達差異倍數(shù)(foldschange)=2-△△Ct,其中△△Ct=(CtER-CGAPDH)實驗組-(CtER-CtGAPDH)對照組。4.數(shù)據(jù)處理組間差異所有數(shù)據(jù)以表示,利用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理組間差異采用方差分析,兩兩比較用最小顯著差異t檢驗(LSD-t檢驗),以P<0.01為差異有統(tǒng)計學意義。結果1.馬馬區(qū)雌激素受體的形成2.比較塞爾堡區(qū)的mrna和mrna的比較3.5-ht、i-末年和ne含量的比較圍絕經(jīng)期綜合征肝郁證相關因素既往研究表明,無論是圍絕經(jīng)期綜合征患者還是圍絕經(jīng)期綜合征動物模型,不僅體內的雌激素水平降低,而且雌激素受體的數(shù)量也有減少。動物實驗研究表明,在卵巢切除的小鼠中發(fā)現(xiàn)循環(huán)雌激素水平的降低是一個不可逆的過程,而雌激素受體的表達卻呈現(xiàn)一個可逆的過程,即隨著循環(huán)雌激素的下降,雌激素受體的表達首先也會下降,但是經(jīng)過一段時間之后最終又會上升到正常水平。RomanoTorres等的研究結果表明,雌激素對于中年卵巢切除(人類絕經(jīng)期的動物模型)慢性抑郁模型大鼠具有抗抑郁的作用,雌激素水平下降和孕酮調節(jié)功能的喪失可能會導致圍絕經(jīng)期婦女產(chǎn)生心境障礙。此外圍絕經(jīng)期女性的低雌激素血癥及體內性腺甾體激素衰退,使中樞和周圍的單胺類和鴉片肽類神經(jīng)遞質濃度發(fā)生變化是導致植物性自主神經(jīng)系統(tǒng)和精神癥狀發(fā)生的基礎,是發(fā)生圍絕經(jīng)期綜合征癥狀的基礎。雌激素受體(estrogenreceptor,ER)是雌激素發(fā)揮作用的重要節(jié)點。AliciaA.Walf等的研究結果提示,雌二醇(estradiol,E2)可能通過卵巢切除大鼠的海馬區(qū)ERβmRNA發(fā)揮抗焦慮和抗抑郁的作用。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)ERβ多態(tài)性(rs3020444)與圍絕經(jīng)期綜合征肝氣郁結證(氣郁證)相關,ERβ-TT基因型可能是圍絕經(jīng)期綜合征氣郁證發(fā)病的易感因素之一。由于雌激素的生物效應是由雌激素受體介導完成的,因此有可能雌激素受體的變化影響了神經(jīng)遞質的釋放。本研究證實大鼠海馬區(qū)有雌激素受體的分布,13月齡各組ERαmRNA較育齡空白對照組表達減少,而郁證組與對照組表達有所減少,郁證組ERβmRNA與對照組、中藥干預組相比表達增多,但沒有顯著性差異;各組GPR30mRNA表達沒有顯著性差異。雖然ERα、ERβmRNA單個表達組間差異不顯著,但是本實驗首次發(fā)現(xiàn)了圍絕經(jīng)期綜合征郁證大鼠ERαmRNA/ERβmRNA比值較空白對照組、對照組、圍絕經(jīng)期綜合征肝郁證加中藥組均有顯著性下降,予以中藥干預后ERαmRNA/ERβmRNA上升,提示圍絕經(jīng)期綜合征肝郁證的產(chǎn)生有可能并不是單個ERα、ERβmRNA的表達變化,而是與其比值有關,因此ERα/ERβ的比例下降可能是圍絕經(jīng)期綜合征肝郁證的生物學基礎,這一發(fā)現(xiàn)對于明確圍絕經(jīng)期肝郁證治療藥物靶點研究有重要意義,即雌激素受體比例ERαmRNA/ERβmRNA變化可以作為肝郁證治療的研究指標。本課題組沒有發(fā)現(xiàn)膜受體GPR30mRNA變化,是否是因為膜受體參與快速應答為主,而郁證變化是一個慢性改變過程,其有待進一步研究。圍絕經(jīng)期的雌激素改變導致血清中神經(jīng)遞質含量明顯改變。β-END參與垂體促性腺激素的釋放、體溫調節(jié)以及情緒反應,它的改變與圍絕經(jīng)期癥狀及其程度密切相關。研究顯示女性5-HT合成速率較正常男性低52%,間接提示雌激素可以減少5-HT合成。郁證患者普遍存在5-HT、NE、多巴胺(DA)等低下,且在臨床上抗抑郁治療有效的藥物幾乎都能夠增加細胞突觸間隙5-HT和NE的水平。雌激素受體廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的基底前腦、間腦、中腦、海馬、杏仁體、大腦皮質、小腦皮質等位置。但是雌激素通過哪些核團起到抗抑郁作用目前還不明確,海馬是目前研究較深入且與抑郁癥發(fā)病關系最密切的核團,抑郁癥患者與正常人相比海馬體積減小。許多研究表明在受到應激刺激后海馬介導的行為在不同性別動物中的反應不同,這些都說明海馬可能是雌激素對抗抑郁癥狀的一個靶點。本研究證實海馬區(qū)的5-HT和NE含量在圍絕經(jīng)期肝郁證組顯著下降,經(jīng)治療后5-HT、NE表達均升高,此結果與既往研究類似,但是β-END的含量各組卻沒有發(fā)現(xiàn)明顯改變。圍絕經(jīng)期綜合征中醫(yī)稱之為“絕經(jīng)前后諸證”,歷代古籍將其歸于“百合病”、“郁證”、“臟躁”、“崩漏”、“心悸”等范疇。絕經(jīng)本是女子正常的生理現(xiàn)象,正如《黃帝內經(jīng)》所云:“七七任脈虛,太沖脈衰少,天癸竭,地道不通,故形壞而無子也”。部分婦女不能適應這個階段的生理過渡,發(fā)生氣機郁滯,肝失調達的圍絕經(jīng)期綜合征肝郁證候,本課題組的前期研究亦認為肝郁是這一時期的主要矛盾,因此本研究用自然衰老和慢性束縛大鼠模型較好地模擬了這特定時期的郁證表現(xiàn),且經(jīng)柴胡疏肝散“以方測證”的方法證實了這一理論。以方測證法廣泛應用于傳統(tǒng)方證認識和現(xiàn)代證候研究,其邏輯基礎源于《傷寒論》的“方證相應”。本研究中筆者以“以方測證”方法證明圍絕經(jīng)期綜合征肝郁證系列的神經(jīng)心理變化的生物學基礎有可能在于雌激素波動影響海馬區(qū)ERαmRNA/ERβmRNA表達,引起神經(jīng)遞質5-HT、NE變化,卻沒有出現(xiàn)肽類遞質β-END的改變,此實驗結果與既往研究不同。既往研究圍絕經(jīng)期綜合征多數(shù)選用去勢大鼠造模,而本研究選用的是自然衰老的大鼠,較前者更能模擬女性自然的生理變化過程,這也許是結果異于以往研究的原因之一。見圖1-圖3。用Real-timePCR檢測圍絕經(jīng)期綜合征肝郁證大鼠海馬雌激素受體的mRNA表達。ERαmRNA表達B、D、E組較A組減少,有顯著性差異(P<0.01),E組與D組比較,表達有所減少,但沒有顯著性差異;ERβmRNA表達E組與B、C、D組相比增多,但沒有顯著性差異;各