菠菜內(nèi)生拮抗細菌的分離、篩選與鑒定

菠菜內(nèi)生拮抗細菌的分離、篩選與鑒定摘要：從菠菜葉片上和菜園土壤中分離細菌，篩選出對菠菜霜霉病菌或菠菜炭疽病菌拮抗作用強的菌株，并挑選出生活力強、適應(yīng)性好、防病效果好的作為目標菌株，并其鑒定到種。技術(shù)路線：菠菜內(nèi)生細菌的分離拮抗菌株的篩選目標菌株的鑒定拮抗菌株的生物學(xué)測定1實驗材料1.1樣品來源菠菜菜園內(nèi)土壤和菠菜植株。1.2供試病原菌菠菜霜霉病菌(Peronosporaeffusa)和菠菜炭疽病菌(Colletotrichumspinaciae),由本實驗室分離和鑒定。1.3培養(yǎng)基細菌的分離用NA、KB和TSA。細菌的培養(yǎng)用NA或LB。細菌的菌種保存用NA或YPA。真菌的培養(yǎng)與拮抗測定用PDA。細菌的生理生化測定用基礎(chǔ)培養(yǎng)基。1.4標準菌株枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)標準菌株。西瓜細菌性果斑病病菌(Acidovoraxavenaesubsp.citrulliWillemsetal.1992)標準菌株Aac7500。1.5溶液與試劑草酸銨結(jié)品紫染劑，魯戈爾碘液，番紅復(fù)染劑，西薩一基爾染媒劑，苯酚品紅染劑，7.6%孔雀綠水溶液，1%漠百里酚藍水溶液，甲基紅試劑，0.3%肌酸水溶液，格里斯試劑，吲哚試劑，10%(W/V)FeCl3溶液，1%二甲基對苯撐二胺水溶液，3%(v/v)過氧化氫。2實驗方法2.1菠菜內(nèi)生細菌的分離從菠菜的健葉和病葉上取樣，各取1.0g，先用70%酒精浸泡5min，再用0.2%升汞表面消毒2-3min，無菌水沖洗3次。取0.5ml最后1次無菌水沖洗液涂布接種于各種培養(yǎng)基上。每個處理重復(fù)3次，培養(yǎng)48h，觀察有無菌落產(chǎn)生。據(jù)此驗證此消毒方法是否能全部殺死供試材料表面微生物。樣品晾十后轉(zhuǎn)入無菌研缽中研磨勻漿，加5ml無菌水碾碎，靜止15min后，各取50l涂平板，每處理重復(fù)3次，30°C黑暗培養(yǎng)48-72h，計算菌落數(shù)。根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等挑取單菌落，按常規(guī)方法純化后保存，供測試鑒定。2.2菠菜病原菌拮抗菌株的篩選采用對峙生長法，測定以上分離菌株對菠菜霜霉病菌或菠菜炭疽病菌的拮抗性。具體步驟：在直徑為9cm的PDA平板中央接入直徑為8mm的病原真菌菌塊，同時在平板四個邊緣距中央中心處接入一小環(huán)目標菌株菌落(37C，NA上培養(yǎng)24h)，28C下黑暗培養(yǎng)，設(shè)不接種的為對照。3d后觀察各個菌株對病菌的拮抗效果。2.3拮抗菌株的鑒定2.3.1常規(guī)測定革蘭氏染色將細菌接種在斜面上，25C培養(yǎng)24?28h后，用結(jié)品紫草酸銨染色法進行染色，鏡檢。鞭毛染色將細菌在斜面上培養(yǎng)18?24h后，用西薩一基爾染色法進行染色，鏡檢。芽孢染色將菌株培養(yǎng)48?72h后，用孔雀綠藏紅染色法染色，然后鏡檢。2.3.2生理生化測定葡萄糖氧化發(fā)酵實驗培養(yǎng)基：蛋白胨2.0g，NaCl5.0g，K2HPO40.2g，葡萄糖10.0g，瓊脂6.0g，漠百里酚藍，1%水溶液3ml,蒸餾水1000.0ml，pH7.0-7.2，分裝，滅菌。穿刺接種，每株4支，其中兩支用滅菌的凡士林封蓋，約0.5—1cm，以隔絕空氣為閉管，另兩支不封為開管，同時用不接種的閉管和開管作對照。適溫培養(yǎng)1、2、3、7、14d觀察結(jié)果。只有開管產(chǎn)酸變黃者為氧化型，開管和閉管均產(chǎn)酸變黃者為發(fā)酵型。硝酸鹽還原試驗每支試管分裝5mL含有硝酸鹽的培養(yǎng)基(KNO31.0g，蛋白胨5.0g，酵母粉3.0g，瓊脂3.0g，蒸餾水1000.0ml，pH7.0-7.2)，滅菌后每個菌株針刺接種4管，其中2支用3%瓊脂封管，置25C培養(yǎng)2周，若在封管的瓊脂下有氣泡產(chǎn)生，表示有脫氮的作用，未封管的試管在培養(yǎng)3、5、7d后用Griess-Liosvary試劑(試劑A：對氨基苯磺酸8.0g，5N醋酸1000.0ml；試劑B：二甲-a-奈胺6.0ml，5N醋酸1000.0ml)測定，每管加試劑A和B各1ml，如呈紅色，表示有亞硝酸根。明膠液化每支試管分裝5ml含明膠的培養(yǎng)基(牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，明膠120.0g，蒸餾水1000.0mL)，滅菌后穿刺接種細菌，置25C下培養(yǎng)，定期觀察明膠是否液化。淀粉水解細菌接種在淀粉培養(yǎng)基平板上(牛肉膏2.0g，蛋白胨17.5g，淀粉1.5g，瓊脂17.0g,蒸餾水1000.0mL，pH7.0)，置25°C下培養(yǎng)4小時，然后往平板上加碘液，此時培養(yǎng)基是否呈深藍色，若菌落周圍為無色透明圈者為陽性。苯丙氨酸脫氨酶將細菌在斜面(培養(yǎng)基：酵母膏3g，NaCl5g，Na2HPO41g，瓊脂12g，L一苯丙氨酸1g，蒸餾水1000mL)上37C培養(yǎng)4h或8?24h測定，將試劑10%(W/V)的FeCl3溶液滴到斜面上，當斜面上和冷凝水中產(chǎn)生綠色時為陽性反應(yīng)，即表明已形成了苯丙氨酸，不變則為陰性。吲哚的產(chǎn)生把細菌接種于1%胰胨水溶液中適溫培養(yǎng)1、2、4、7d后，沿管壁緩慢加入3?5mm高的試劑于培養(yǎng)液表面，在液層面發(fā)生紅色，即為陽性反應(yīng)。若顏色不明顯，可加4?5滴乙醚全培養(yǎng)液，搖動，使乙醚分散于液體中，將培養(yǎng)液靜置片刻，待乙醚浮全液面后再加吲哚試劑。如培養(yǎng)液中有吲哚時，吲哚可被提取在乙醚層中，濃縮的吲哚和試劑反應(yīng)，則顏色明顯。V-P測定將目標菌株在NA斜面上培養(yǎng)24?48h，加入3?5ml的蒸餾水，配成菌懸液，每管加入5ul的菌懸液標記分別培養(yǎng)2、4、6d，測試時將培養(yǎng)液體加入40%NaOH等量相混，加少許肌酸，過10min或更長觀察結(jié)果，如果出現(xiàn)紅色為陽性反應(yīng)，否則為陰性。糖、醇類的利用芽孢桿菌培養(yǎng)基((NH4)2HPO41.0g，KCl0.2g，MgSO40.2g，酵母膏0.2g，瓊脂5.0-6.0g，糖類或醇類(D-木糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、乳糖或D-甘露醇)10.0g蒸餾水1000ml漠百里酚藍0.04%)PH7.0-7.2分裝試管112oC滅菌30min。穿刺接種25C培養(yǎng)1、3、5d后觀察，如果變黃色說明陽性不變或變藍說明陰性。接觸酶測定將24h培養(yǎng)的目標菌株，以鉑絲接種環(huán)抹一小環(huán)于滴有3%的過氧化氫玻片上，如果有氣泡產(chǎn)生則為陽性，如果無氣泡為陰性。(10)檸檬酸鹽的利用將目標菌株在NA斜面上培養(yǎng)24h?48h，加入3?5ml的蒸餾水配成菌懸液，每管加入50ul的菌懸液混合，過1、3、7d后觀察，如果由綠色變成藍色并有明顯氣泡產(chǎn)生則為陽性反應(yīng)，無明顯變蘭色則為陰性反應(yīng)。2.4拮抗菌株的生物學(xué)功能測定2.4.1拮抗性測定采用夾層法測定拮抗菌株對菠菜霜霉病菌菌絲或菠菜炭疽病菌菌絲的抑制率。具體步驟:在100mL熔解后冷卻至45C左右的PDA培養(yǎng)基中加入1mL拮抗菌株菌液(含菌量3x108CFU/mL)，混勻后制成含菌平板(約15mL培養(yǎng)基)，然后平板中央接入直徑為8mm的病原真菌菌塊。28C下黑暗培養(yǎng)，設(shè)不接種的為對照。5和7d分別測量抑菌圈直徑(mm)和真菌菌落直徑(mm)。抑制率的計算公式：抑制率(%)=(對照真菌菌落直徑一受抑制真菌菌落直徑)/對照真菌菌落直徑x100。采用載玻片懸滴法測定拮抗菌株對菠菜霜霉病菌孢子囊萌發(fā)或菠菜炭疽病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用。具體的做法是用直徑為5mm的打孔器在上述抑菌圈邊緣切取菌塊，用定量無菌水制成孢子囊或分生孢子的懸浮液，血球計數(shù)板計算每菌塊中的孢子囊數(shù)或分生孢子數(shù)，以正常培養(yǎng)的病菌菌絲塊為對照，計算孢子囊形成或分生孢子形成的抑制率（％）。分別用目標菌株培養(yǎng)液（28°C、180rpm、培養(yǎng)48h）和清水配制病原菌孢子囊或分生孢子懸浮液，用載玻片懸滴法室溫培養(yǎng)，觀察孢子囊或分生孢子的萌發(fā)率（%）。2.4.2內(nèi)生性測定用逐步篩選法，篩選抗利福平的突變菌株，即將供試菌株轉(zhuǎn)入含50^g/mlRif.的NA平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)，挑取生長的突變體菌株，再接入同一Rif.濃度的NA培養(yǎng)基，繼代一次后轉(zhuǎn)入下一個含有2倍Rif濃度的培養(yǎng)基中，直至篩選出抗300rg/mlRif.的并能在NA培養(yǎng)基平板上定生長且菌落形態(tài)保持不變的抗利福平突變體菌株。把抗Rif突變菌株在含300rg/mlRif.的NB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)（37C，180r/min）24h，然后用培養(yǎng)液（含菌量約為5X106cfu/ml）噴霧接種菠菜幼苗，接種量為5mL/株。常規(guī)條件下進行肥水和栽培管理，以不接菌為空白對照。3、7、10、14、21和30d分別取樣，每次收集菠菜2g。樣品經(jīng)70%酒精和0.1%升汞表面消毒后，無菌水沖洗3次，加定量無菌水研磨勻漿，靜止15min后，吸取適量液體涂于含300rg/mLRif.的NA平板，每處理重復(fù)3次，37C黑暗培養(yǎng)48h，計算菌落數(shù)。分離時各處理組織在表面消毒清洗后，于分離平板上進行表面印跡培養(yǎng)，48h長菌的相應(yīng)分離處理為無效試驗。觀察分離菌株在NA平板上的生長菌落。2.4.3防病測定拮抗菌株的接種采用噴霧法；菠菜病原菌的接種采用灌根法或針刺法，測定拮抗菌株對茶輪斑病的防病效果。接種時拮抗菌株稀釋成3x108CFU/mL的菌懸液，茶輪斑病菌配成104孢子/mL的孢子懸浮液。設(shè)同時接種拮抗菌株和菠菜病菌、先接種目標菌株24h后接種菠菜病菌和先接種菠菜病菌24后接種拮抗菌株等3個處理，每處理重復(fù)3次，以只接種菠菜病菌、只接種清水和只接種培養(yǎng)基的處理為對照。26C下保濕培養(yǎng)48h后按正常管理，待發(fā)病后，每天記錄發(fā)病情況，將病斑分為五級，計算各處理的病情指數(shù)。目標菌株防病效果的計算公式為：防病效果（％）=（病菌對照的病情指數(shù)一處理的病情指數(shù)）/病菌對照的病情指數(shù)x100。附錄I培養(yǎng)基配方1營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）主要用于細菌的分離和培養(yǎng)，也可用于細菌的純化和保存。不加瓊脂粉，即配成營養(yǎng)肉湯（NB）培養(yǎng)液。培養(yǎng)基成分如下：蛋白胨5.0g牛肉浸膏3.0g葡萄糖2.5g酵母粉1.0g瓊脂粉16.0?18.0g蒸餾水1000mlpH7.0?7.2配制方法：將稱好的瓊脂，加熱熔化；另稱取蛋白胨、牛肉浸膏、葡萄糖和酵母粉，溶于少量熱水后加入混勻；用5mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH；然后加水定容至1000ml。分裝試管或三角瓶后，121°C滅菌20min。2Luria-Bertani培養(yǎng)基（LB）本培養(yǎng)基營養(yǎng)比較充分，主要用于細菌的液體培養(yǎng)。加入16.0?18.0g的瓊脂粉，配成固體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基成分：酵母粉5.0g胰蛋白胨10.0gNaCl10.0g蒸餾水1000mlpH7.2?7.4配制方法：稱取酵母粉、胰蛋白胨和NaCl，溶于適量蒸餾水；用5mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH；然后加水定容至1000ml。分裝試管或三角瓶后，121C滅菌20min。3金氏B培養(yǎng)基（KB）本培養(yǎng)基主要用于細菌（熒光假單胞桿菌）的分離。培養(yǎng)基成分：蛋白胨20.0gMgSO4?7H2O1.5gk2hpo4?h2o1.8g純甘油10.0ml瓊脂粉16.0?18.0g蒸餾水1000mlpH7.2?7.4配制方法：將稱好的瓊脂，加熱熔化；另稱量蛋白胨、MgSO4?7H2O、K2HPO4?H2O和純甘油，溶于少量熱水后加入混勻；用5mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH；然后加水定容

至1000ml。分裝三角瓶后，112°C滅菌30mino4胰蛋白胨大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）胰蛋白腺大豆腺NaCl瓊脂蒸餾水胰蛋白腺大豆腺NaCl瓊脂蒸餾水pH15.0g5.0g5.0g16.0?18.0g1000ml7.2?7.4配制方法：將稱好的瓊脂，加熱熔化；另稱取胰蛋白腺、大豆月東和NaCl,溶于少量熱水后加入混勻；用5mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH；然后加水定容至1000ml。分裝三角瓶后，121C滅菌20min。5酵母粉瓊脂培養(yǎng)基（YPA）本培養(yǎng)基營養(yǎng)較少，主要用于細菌的長期保存。培養(yǎng)基成分：TOC\o"1-5"\h\z酵母粉 3.0gNH4Cl 0.5gKCl 0.2gMgSO47H2O 0.2gK2HPO4 1.0g瓊脂粉 5.0g蒸餾水 1000mlpH 7.0?7.2配制方法：將稱好的瓊脂，加熱熔化；另稱量酵母粉、NH4Cl、KCl、MgSO4?7H2O和K2HPO4，溶于少量熱水后加入混勻；用5mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH；然后加水定容至1000ml。分裝三角瓶后，112C滅菌30min。6基礎(chǔ)培養(yǎng)基（CM）主要用于細菌糖或醇的利用和分解試驗。加入3.0?5.0g的瓊脂粉，可以配成半固體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基成分：TOC\o"1-5"\h\zNH4NO3 1.0gMgSO4.7H2O 0.5g（NH4）2SO4 0.5gKH2PO4 0.5gK2HPO4 1.5gNaCl 0.5g蒸餾水 1000mlpH 7.0?7.2配制方法：先稱取所有藥品，溶于少量熱水，調(diào)節(jié)pH后加入3ml1%漠百里酚藍水溶液，待呈綠色，再加入糖、醇至終濃度為0.1?0.2%，使之溶解，然后加水定容至1000ml。分裝試管后，121°C滅菌20mino7蛋白胨水培養(yǎng)基主要用于細菌的糖或醇的發(fā)酵試驗，也可用于細菌的硝酸鹽還原試驗。培養(yǎng)基成分：蛋白腺 10.0gNaCl 5.0g蒸餾水 1000mlpH 7.2?7.4配制方法：先稱取蛋白腺和NaCl，溶于少量熱水，調(diào)節(jié)pH后加入溴甲酚紫（1.6%水溶液），待呈紫色，再加入糖、醇或KNO3至終濃度為0.1?0.2%，使之溶解，然后加水定容至1000ml。分裝試管后，最后將杜氏小管倒置放入試管中（觀察試驗中是否有產(chǎn)氣）。121C滅菌20min。8馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）主要用于真菌的分離、培養(yǎng)和保存，以及細菌對真菌的拮抗測定。也可用蔗糖代替葡萄糖，這樣配制的培養(yǎng)基也稱為PSA。不加瓊脂粉，即配成PDA培養(yǎng)液。培養(yǎng)基成分：馬鈴薯 200g葡萄糖（或蔗糖） 20.0g瓊脂 16.0?18.0g蒸餾水 1000mlpH 自然配制方法：將馬鈴薯洗凈去皮，稱量，切成小塊，放入鍋中，加蒸餾水1000ml，煮沸30min；稍冷后，用四層紗布濾去馬鈴薯殘渣；將濾液放回鍋中，加入稱好的瓊脂，加熱熔化；然后加入葡萄糖或蔗糖，充分溶解后，補加蒸餾水，定容至1000ml。分裝試管或三角瓶后，121C滅菌20min。1常用緩沖液（1）0.2mol/L磷酸鹽緩沖液pH0.2mol/LNa2HPO4/ml0.2mol/LNaH2PO4/mlpH0.2mol/LNa2HPO4/ml0.2mol/LNaH2PO4/ml5.88.092.07.061.039.05.910.090.07.167.033.06.012.387.77.272.028.06.115.085.07.377.023.06.218.581.57.481.019.06.322.577.57.584.016.06.426.573.57.687.013.06.531.568.57.789.510.56.637.562.57.891.58.56.743.556.57.993.07.06.849.551.08.094.75.36.955.045.0注：NaHPO?2HO分子量=178.05,0.2mol/L溶液含35.61g/L；NaHPO?12HO分子量=2 4 2 2 4 2358.22,0.2mol/L溶液含71.64g/L；NaH2PO4?H2O分子量=138.01,0.2mol/L溶液含27.6g/L；NaH2PO4?2H2O分子量=156.03,0.2mol/L溶液含31.21g/L。(2)0.1mol/LTris-HCl緩沖液pHX/mlpHX/ml7.145.78.126.27.244.78.222.97.343.48.319.97.442.08.417.27.540.38.514.77.638.58.612.47.736.68.710.37.834.58.88.57.932.08.97.08.029.2注：三羥甲基氨基甲烷（Tris）分子量=121.14,0.1mol/L溶液為12.114g/L。50ml0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷（Tis）溶液于Xml0.1mol/L鹽酸混勻后，加水稀釋至100ml。Tris溶液可以從空氣中吸收二氧化碳，使用時注意將瓶蓋嚴。(3)0.2mol/L硼酸-硼砂緩沖液pH0.05mol/L硼砂/ml0.2mol/L硼酸/mlpH0.05mol/L硼砂/ml0.2mol/L硼酸/ml7.41.09.08.23.56.57.61.58.58.44.55.57.82.08.08.76.04.08.03.07.09.08.02.0注：硼砂Na2B4O7?10H2O分子量=381.43,0.05mol/L(=0.2mol/L硼酸根)溶液為19.07g/L；硼酸H3BO3分子量=61.84,0.2mol/L溶液為12.37g/L。硼砂易失去結(jié)晶水，必須在帶塞的瓶中保存。(4)0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液pH0.1mol/L檸檬酸/ml0.1mol/L檸檬酸鈉/mlpH0.1mol/L檸檬酸/ml0.1mol/L檸檬酸鈉/ml3.018.61.45.08.211.83.217.22.85.27.312.73.416.04.05.46.413.63.614.95.15.65.514.53.814.06.05.84.715.34.013.16.96.03.816.24.212.37.76.22.817.24.411.48.66.42.018.04.610.39.76.610418.64.89.210.8注：檸檬酸C6H8O7?H2O分子量=210.14,0.1mol/L溶液含21.01g/L；檸檬酸鈉Na3C6H5O7-2H2O分子量=294.12,0.1mol/L溶液含29.41g/L。(5)0.2mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液pH0.2mol/LNaAc/ml0.2mol/LHAC/mlpH0.2mol/LNaAc/ml0.2mol/LHAC/ml3.60.759.254.85.904.103.81.208.805.07.003.004.01.808.205.27.902.104.22.657.355.48.601.404.43.706.305.69.100.904.64.905.105.89.400.60注：NaAc分子量=136.09,0.2mol/L溶液為27.22g/L。2細菌染色