黃牛鼻中透明質(zhì)酸產(chǎn)生菌的分離與鑒定

黃牛鼻中透明質(zhì)酸產(chǎn)生菌的分離與鑒定

h-1是由n-3-糖苷鍵和n-4-糖苷鍵組成的高等直覺(jué)酸，廣泛存在于高等動(dòng)物的結(jié)構(gòu)體和一些細(xì)菌中。由于其溶液具有高粘性和獨(dú)特的粘彈性而廣泛應(yīng)用于臨床、診斷、化妝品等領(lǐng)域。透明質(zhì)酸的生產(chǎn)方法主要有提取法和發(fā)酵法兩種。由于組織提取成本較高、工藝復(fù)雜,因此應(yīng)用更多的是以鏈球菌為發(fā)酵菌種的微生物發(fā)酵法。目前透明質(zhì)酸的產(chǎn)生菌主要為鏈球菌A群和C群。其中鏈球菌A群具有人致病性,所以一般采用鏈球菌C群為發(fā)酵起始菌株。國(guó)外發(fā)酵法HA生產(chǎn)已達(dá)產(chǎn)業(yè)化階段,但我國(guó)利用發(fā)酵法生產(chǎn)HA的技術(shù)仍不成熟,關(guān)鍵是沒(méi)有高產(chǎn)HA的菌種。所以從自然界尋找HA高產(chǎn)菌株已成為發(fā)酵法生產(chǎn)HA的研究熱點(diǎn)。作者從新鮮的水牛鼻粘膜分離篩選出15株菌株,經(jīng)生化反應(yīng)鑒定其中5株為透明質(zhì)酸產(chǎn)生菌。對(duì)HA產(chǎn)量最高的菌株的發(fā)酵液精提物進(jìn)行紅外吸收光譜、核磁共振、紫外吸收光譜分析,并對(duì)其進(jìn)行超聲波/紫外線復(fù)合誘變,透明質(zhì)酸產(chǎn)量大幅提高。1實(shí)驗(yàn)1.1材料表面新鮮水牛鼻粘膜,采自南京市江寧區(qū)某養(yǎng)牛專(zhuān)業(yè)戶(hù)新宰殺水牛,共24份。1.2培養(yǎng)基(1)ph值的測(cè)定方法牛腦浸粉10.0g,牛心浸粉10.0g,胰蛋白胨10.0g,葡萄糖2.0g,NaCl5.0g,瓊脂20.0g,加蒸餾水至1000mL,調(diào)pH值至7.0,121℃下滅菌20min。(2)血瓊脂酸培養(yǎng)基將滅菌后的腦心浸液培養(yǎng)基冷卻至50℃,在無(wú)菌條件下加入10%新鮮無(wú)菌脫纖維羊血后倒入平板冷卻。(3)血清清髓細(xì)胞度測(cè)定葡萄糖10.0g,酵母膏10.0g,牛肉膏10.0g,MgSO4·7H2O2.0g,K2HPO42.0g,加蒸餾水至1000mL,調(diào)pH值至7.0,121℃下滅菌20min,冷卻至常溫,在無(wú)菌條件下加入10%小牛血清。(4)預(yù)處理葡萄糖10.0g,酵母膏20.0g,MgSO4·7H2O2.0g,K2HPO42.0g,加蒸餾水至1000mL,調(diào)pH值至7.0,121℃下滅菌20min。1.3細(xì)菌的分離與篩選1.3.1菌株在血培養(yǎng)基上的穩(wěn)定性測(cè)定將新鮮的水牛鼻粘膜接入1%蛋白胨溶液中,36℃、150r·min-1下?lián)u床培養(yǎng)12h。將培養(yǎng)液梯度稀釋至不同濃度分別涂布于血瓊脂平板上,36℃下培養(yǎng)24h。觀察各菌落在血瓊脂平板上的形態(tài)和溶血性,用接種針挑起看粘度。選取與文獻(xiàn)描述類(lèi)似的菌株,革蘭氏染色鏡檢,并進(jìn)行鏈球菌C群生化反應(yīng)鑒定。1.3.2硫酸城市酸鈉ha及其制備方法取初篩菌株1～2環(huán),接入種子培養(yǎng)基中,36℃、200r·min-1下培養(yǎng)16h,轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基中,繼續(xù)在36℃、200r·min-1下培養(yǎng)48h,接種量為10%。發(fā)酵液經(jīng)5000r·min-1離心10min,上清液加入2.5BV乙醇,沉淀完全,再次離心10min,取沉淀加入與起始發(fā)酵液等量的生理鹽水溶解,稀釋適當(dāng)倍數(shù)后以硫酸咔唑法測(cè)定HA的產(chǎn)量。選取產(chǎn)量最高菌株的發(fā)酵液參照文獻(xiàn)提純,對(duì)發(fā)酵液精提物進(jìn)行紅外吸收光譜(IR)、核磁共振(13CNMR)、紫外吸收光譜(UV)分析,并對(duì)其進(jìn)行誘變。1.4細(xì)菌的誘導(dǎo)1.4.1角瓶不同菌落的制備將細(xì)菌培養(yǎng)液在4000r·min-1下離心5min,傾去上清液,將菌體打散,加入無(wú)菌生理鹽水洗滌數(shù)次,重新懸浮于10mL生理鹽水中,搖勻后倒入裝有玻璃珠的已滅菌三角瓶?jī)?nèi),振蕩20min。菌液過(guò)濾,單細(xì)胞濾液裝入管內(nèi),作為待處理液。1.4.2紫外照射處理取10mL處理好的單細(xì)胞培養(yǎng)液用超聲波破碎,在20kHz、200W、220V的超聲條件下處理10min,梯度稀釋,涂布于血瓊脂平板上,暗培養(yǎng)24h。取其中菌落大、隆起高的菌落,再次制備單細(xì)胞培養(yǎng)液。取10mL單細(xì)胞培養(yǎng)液加入培養(yǎng)皿內(nèi),置于磁力攪拌器上紫外照射90s,紫外燈的功率為20W、照射距離為30cm。菌液梯度稀釋,涂布于血瓊脂平板上,暗培養(yǎng)24h。1.4.3透明質(zhì)酸含量測(cè)定從血瓊脂平板上挑菌落大、隆起高、溶血性較弱的菌株。選取1～2環(huán)接入裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中,36℃、200r·min-1下培養(yǎng)16h,轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基中,繼續(xù)在36℃、200r·min-1下培養(yǎng)48h,接種量為10%,測(cè)定各菌株透明質(zhì)酸的含量。選取HA產(chǎn)量較高的菌株,傳代6次后重復(fù)以上操作,再次測(cè)定HA含量。2結(jié)果與討論2.1革蘭氏染色鏡檢及生化反應(yīng)鑒定按1.3.1方法,選擇血瓊脂平板上圓而微凸、有光澤、用接種針挑起呈明顯絲樣粘連狀的菌株進(jìn)一步分離純化,得到15株具有鏈球菌典型菌落特征的菌株。將其編號(hào)為A～O,進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢及生化反應(yīng)鑒定,結(jié)果見(jiàn)表1。適宜產(chǎn)HA的鏈球菌C群特征為β-溶血、革蘭氏陽(yáng)性菌、水解七葉苷、水解精氨酸、不水解明膠、不水解馬尿酸鹽。由鏡檢、溶血性、生化反應(yīng)特征鑒定結(jié)果判斷,菌株B、G、H、J、M符合鏈球菌C群的特征,進(jìn)一步搖瓶復(fù)篩;菌株E、I非β-溶血,革蘭氏染色陰性,為雜菌,棄去;其余菌株雖具有鏈球菌的菌落特征,但不符合鏈球菌C群的生化反應(yīng)特征,雖可能產(chǎn)生透明質(zhì)酸,但亦可能具有致病性,不宜作為發(fā)酵起始菌株,棄去。2.2細(xì)菌復(fù)驗(yàn)證2.2.1菌株產(chǎn)酸能力采用硫酸咔唑法測(cè)定菌株B、G、H、J、M的HA產(chǎn)量,結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出,菌株B產(chǎn)酸能力最強(qiáng),為0.793g·L-1;其次是H和M,產(chǎn)酸量在0.65g·L-1左右;菌株J產(chǎn)HA能力最差,僅為0.305g·L-1。由于菌株B產(chǎn)HA能力最強(qiáng),選擇B作為誘變起始菌株,并對(duì)其發(fā)酵液精提物進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。2.2.2縮裂振動(dòng)特征吸收峰的鑒定用KBr壓片法制備樣品,掃描范圍為4000～700cm-1。菌株B發(fā)酵液精提物紅外吸收光譜圖如圖2所示。從圖2可以看出,菌株B發(fā)酵液精提物在3400cm-1處出現(xiàn)強(qiáng)烈的-OH的伸縮振動(dòng)特征吸收峰,表明有多羥基結(jié)構(gòu);在2920cm-1附近有-CH2、-CH或-CH3的伸縮振動(dòng)特征吸收峰;在1620cm-1、1560cm-1處有-C=O、-C-N的伸縮振動(dòng)特征吸收峰,表明存在乙酰氨基結(jié)構(gòu);在1400～1320cm-1處有-COO中-C-O的伸縮振動(dòng)和-OH的彎曲振動(dòng)耦合產(chǎn)生的2個(gè)吸收峰,表明存在解離羧基結(jié)構(gòu)和多糖羥基結(jié)構(gòu)的糖醛酸。發(fā)酵液精提物與HA標(biāo)準(zhǔn)品紅外吸收?qǐng)D譜基本一致。2.2.3側(cè)基上-ch3的特征峰對(duì)菌株B發(fā)酵液精提物進(jìn)行核磁共振分析,頻率為300MHz,掃描溫度為313K,控溫誤差為±0.1℃。結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出,在δ177.51及δ176.61處出現(xiàn)-COO-及=CO的特征峰;在δ105.80和δ103.15處出現(xiàn)-O(O)CH-的特征峰;在δ71.17～δ85.49處出現(xiàn)一系列=CHOH的特征峰;在δ56.93處出現(xiàn)=CHNH的特征峰;在δ60.25處出現(xiàn)側(cè)基-CH2OH的特征峰;在δ25.11處出現(xiàn)側(cè)基上-CH3的特征峰。由菌株B發(fā)酵液精提物與HA標(biāo)準(zhǔn)品的13CNMR圖譜對(duì)比可知,兩者結(jié)構(gòu)基本一致。2.2.4紫外吸收波長(zhǎng)的測(cè)定對(duì)菌株B發(fā)酵液精提物的溶液與HA標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別在190～280nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描,測(cè)定其最大紫外吸收波長(zhǎng),結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖4可以看出,菌株B發(fā)酵液精提物最大吸收波長(zhǎng)為205nm,與HA標(biāo)準(zhǔn)品相同,且兩者的峰型一致。2.3超聲波和紫外表面活性劑的結(jié)合2.3.1紫外線復(fù)合誘變法從圖5可以看出,經(jīng)物理誘變(超聲波/紫外線復(fù)合誘變)處理后,部分菌落明顯變大,隆起變高,呈粘連狀,且溶血性明顯變?nèi)?表明適宜作為發(fā)酵菌株。2.3.2發(fā)酵菌株ha產(chǎn)量測(cè)定采用超聲波/紫外線復(fù)合誘變菌株B,選擇5株菌落大、隆起高、溶血性弱的菌株,分別編號(hào)為B1～B5,發(fā)酵后測(cè)定HA產(chǎn)量,結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可以看出,菌株B3的HA產(chǎn)量最高。選擇菌株B3,傳代6次,搖瓶發(fā)酵測(cè)定其HA產(chǎn)量,