新鮮白蒜氧化褐變酶活性的測定

新鮮白蒜氧化褐變酶活性的測定

白色大蒜屬于大蒜科，為百合科洋蔥屬植物大蒜的前身。白頭蒜的糖制品和腌制品去除了本身辛辣味,減輕了休眠期后的生物學(xué)變化,保證了白頭蒜的營養(yǎng)生理活性,具有很強(qiáng)的營養(yǎng)價(jià)值和醫(yī)療價(jià)值。但是,白頭蒜制品在生產(chǎn)過程中很容易發(fā)生褐變,直接影響著產(chǎn)品的感官性狀,降低了產(chǎn)品的商品價(jià)值,影響著產(chǎn)品的生產(chǎn)。PPO是白頭蒜褐變的主要酶系,它是一種含銅酶,能催化兩類不同的反應(yīng),可以使一元酚羥基化,生成相應(yīng)的鄰二羥基化合物;也可以氧化鄰苯二酚生成黑色物質(zhì)醌。PPO的底物是酚類物質(zhì),果實(shí)中的酚類物質(zhì)很多,其種類和含量會在果實(shí)生長期和成熟期發(fā)生變化,在貯藏過程中隨時(shí)間延長而下降,此時(shí)PPO活性相對地增強(qiáng),褐變加劇。PPO活性的主要影響因素有:(1)氧的存在;(2)酶的作用;(3)含Cu2+輔基的參與;(4)酶與底物的結(jié)合。食品種類不同,各種因素的影響也有較大差異。因此,白頭蒜的褐變主酶PPO的研究和控制方法成為當(dāng)前研究的要點(diǎn)。本文重點(diǎn)研究了白頭蒜的褐變因素主酶PPO的基本特性及控制措施。1材料、試劑和設(shè)備1.1材料表面嫩白頭蒜,購于黑龍江農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)貿(mào)市場,去皮、洗凈,備用。1.2試劑食物等級磷酸氫二鈉,磷酸二氫鈉,鄰苯二酚,NaHSO3,L-cys,EDTA-2Na,抗壞血酸,檸檬酸(CA),聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)。1.3庫森日本H—9R型落地式高速冷凍離心機(jī),日本kokusan(科庫森)產(chǎn)品;UV—1800型紫外可見分光光度計(jì),島津公司產(chǎn)品;數(shù)顯恒溫水浴鍋,蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司提供;PL303型精密電子分析天平,上海精密科學(xué)儀器有限公司提供。2實(shí)驗(yàn)方法2.1緩沖液和總酸緩沖液配比準(zhǔn)確稱取2.000g鮮蒜樣品,放入研缽中,按照1∶5(W/V)加入pH值為6.8的磷酸緩沖液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的PVPP,冰浴研磨成勻漿。將勻漿液全部轉(zhuǎn)入離心管中,于溫度4℃,轉(zhuǎn)速12000r/s下離心25min,吸取上清液,置于4℃下備用。2.2鄰苯二酚對酶催化反應(yīng)的測定分別將3.5mL磷酸緩沖液(濃度為0.05mol/L,pH值為6.8),0.4mL酶液和1mL鄰苯二酚(濃度為0.1mol/L)于37℃下保溫5min,迅速混合,搖勻,于波長410nm處比色測定。酶活:在pH值為6.8,溫度37℃的條件下,以每分鐘吸光度改變0.001為1個(gè)酶活單位(U)。2.3配制不同緩沖液,使反應(yīng)體系的pH值分別為3.3,4.5,5.5,6.0,6.5,6.8,7.0,8.0,9.0。反應(yīng)體系包括緩沖液3mL,粗酶液1mL,鄰苯二酚1mL,30℃保溫5min,反應(yīng)后加入1mL三氯乙酸終止反應(yīng),測其PPO酶活。2.4三氯乙酸吸光度的測定調(diào)整反應(yīng)體系,使反應(yīng)體系分別在25,30,35,40,45,50,60,70,80,90℃條件下反應(yīng)10min,然后加入1mL三氯乙酸終止反應(yīng),測其吸光度值。以PPO酶活為縱坐標(biāo),以溫度為橫坐標(biāo),繪制曲線。2.5鄰苯二酚對三氯乙酸鈉的合成吸取粗酶液0.1mL,配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01%～0.1%,梯度為0.01%的1mLNaHSO3,L-cys,EDTA-2Na,抗壞血酸和檸檬酸溶液,在各試管中分別加入1.5mL濃度為0.1mol/L的底物鄰苯二酚、1.5mL緩沖液、0.5mL添加劑、0.1mL酶液,對照組為1.5mL濃度為0.1mol/L的鄰苯二酚,在10℃下恒溫10min后,加入1mL三氯乙酸終止反應(yīng),測定其PPO活性。3結(jié)果與分析3.1功能態(tài)之間的相互關(guān)系PPO的活性中心被區(qū)分為3個(gè)不同的功能狀態(tài):(1)金屬態(tài)(Met—PPO);(2)脫氧態(tài)(Deoxy—PPO);(3)氧合態(tài)(Oxy—PPO)。多酚氧化酶3個(gè)功能態(tài)之間的相互關(guān)系見圖1。由圖1可以看出,銅決定著PPO的基本特性,影響著PPO的活性。3.2亞硫酸氫鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對大蒜抗氧化酶活性的影響pH值對酶活的影響見圖2,溫度對酶活的影響見圖3,檸檬酸對酶活的影響見圖4,EDTA-2Na對酶活的影響見圖5,亞硫酸氫鈉對酶活的影響見圖6,L-cys對酶活的影響見圖7,VC對酶活的影響見圖8。圖2表明,白頭蒜的最適pH值為7.6,在2.0附近出現(xiàn)了1個(gè)小峰,表明酶液中可能存在著PPO同工酶。pH值超過最適pH值時(shí)酶活迅速呈直線趨勢下降,說明酶正在失活。圖3表明,白頭蒜的PPO活性在30～50℃變化較明顯,45℃時(shí)活性最高。隨著溫度的上升,PPO酶活性逐步下降。圖4表明,白頭蒜的PPO酶活下降趨勢很平緩,說明檸檬酸對PPO的影響很小。機(jī)理分析:檸檬酸的螯合作用使PPO活性降低;檸檬酸本身具有的酸性對反應(yīng)體系的pH值具有調(diào)節(jié)作用,使pH值遠(yuǎn)離PPO活性最適值。圖5表明,EDTA-2Na對PPO酶活的抑制作用與檸檬酸作用相似,主要作用機(jī)理為:其作為金屬螯合劑和PPO中的Cu2+作用,從而抑制PPO活性。圖6表明,隨著亞硫酸氫鈉反應(yīng)體系中質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,酶活性顯著下降,亞硫酸氫鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于0.08%時(shí),PPO活性基本上不再變化,亞硫酸氫鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.08%時(shí),PPO活性基本上僅為對照的1/3左右。因此,亞硫酸氫鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.08%時(shí),即對PPO有明顯的抑制作用,可防止褐變。然而實(shí)際應(yīng)用中要參考食品添加劑的國家使用標(biāo)準(zhǔn)。圖7表明,L-cys對PPO的抑制作用成蛇形分布,說明L-cys對PPO的抑制呈現(xiàn)不穩(wěn)定狀態(tài),雖然具有很明顯的抑制